本发明集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片，属于微流控芯片技术领域。
背景技术
细胞分离是现代生物学的重要组成部分，也是细胞研究中的关键步骤之一，在疾病诊断和单细胞分析中是非常重要的。目前,粒子分离的方法分为主动和被动分离，现阶段的分离技术有磁激发细胞分离技术、荧光激发细胞分离技术、离心分离技术和介电电泳分离技术。在这些方法中，介电电泳免标记分离的细胞可以进一步培养后续的生物分析，还具有低成本、高效、非侵入等优点，可以分离不同类型的粒子，如dna，蛋白质，病毒和细菌等，还成功的分离了高通量并精准筛选能够获得大量的目标细胞，从而应用于细胞生物学、生物医学、组织工程学、药代动力学、组合化学和司法认定等方面的研究。
介电电泳是微粒处于非均匀电场中由于计划现象而产生运动的一种现象。近年来，介电电泳微流控芯片研究已从最初对样品的简单富集操作，扩展到了诸多方面。介电电泳微流控芯片一般采用mems技术加工制作，整个操作过程都比较容易调控和实现集成化、自动化。将介电电泳技术与流体力、电场力、激光镊子等模式集成是研究的新方向，而微流控芯片介电电泳分析系统中的微电极结构是决定效能的关键因素之一，目标微粒和悬浮液的介电常数、电场梯度大小是影响介电电泳力的主要因素，其中电极形状决定电场梯度的方向和大小，因此，电极形状的选择对微流控芯片的设计就非常重要了，而设计出分离性能高、结构合理的微电极结构就成了人们关注的重点。
thp-1细胞和oci细胞是两种人急性髓细胞性白血病细胞，它们直径相近，其细胞直径都为15～20μm，传统上采用介电泳方法分离，但是该方法会对细胞的活性造成影响。
技术实现要素：
本发明集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片，克服了现有技术成本高、成品率低的不足，提供了一种能够用在白血病检测诊断而且不破坏白血病细胞活性的微流控芯片。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片，包括基底和细胞捕获器，基底上溅射有电极对，细胞捕获器上设有一个样品入口和两个样品出口，细胞捕获器包括上捕获层和下捕获层，上捕获层和下捕获层对准键合后形成细胞捕获阵列和微流通道，细胞捕获阵列包括多个同形的单细胞捕获结构，每个单细胞捕获结构包括u形柱和圆柱，u形柱与上捕获层相连，圆柱与下捕获层相连，样品入口贯穿上捕获层后与微流通道的首端相连，微流通道经过电极对后分两路，每路与一个细胞捕获阵列的前端相连，与细胞捕获阵列后端相连的微流通道与贯穿上捕获层的样品出口相连。
进一步，所述电极对中包括多对梯形微电极和插指微电极，梯形微电极的长度为120～480μm，宽度为20～80μm，高度为120～480μm，相邻梯形微电极之间的间隔是20～80μm。
进一步，所述梯形微电极和插指微电极的对数为十对。
进一步，所述基底所用的材料为玻璃。
进一步，所述样品入口的直径为100～460μm，所述样品出口包括第一样品出口和第二样品出口，第一样品出口的直径为60～280μm，第二样品出口的直径为80～320μm。
进一步，相邻两个所述单细胞捕获结构的前后间距为60～100μm，所述u形柱和所述圆柱的上下间距为30～80μm，所述u形柱的弯角处直径为30～80μm，开口处的宽度为60～100μm，所述u形柱的u形口的宽度为8～25μm，所述圆柱的端面直径为40～100μm。
进一步，所述细胞捕获器所用的材料为pdms。
进一步，所述样品为thp-1细胞和oci细胞的混合细胞悬液。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
1.本发明将介电泳的非侵入、免标记与动力学原理低成本的优点结合，利用细胞受到的介电泳力大小或者方向不同而实现分离，利用微捕获结构来捕获单细胞。本发明中的单细胞捕获的结构，不仅效率高、成本低，还可以一次性得到大量的单细胞。
2.本发明利用流体动力学原理来实现单细胞捕获，选用pdms制作双层捕获结构，降低了制作成本，同时增加了芯片的成品率。
3.本发明微流控芯片通过实验测试实现了在一个微流控芯片上集成细胞分离和单细胞捕获两种功能，简化了硬件设施，使微流控芯片使用更加方便。
4.本发明用过氧等离子气体处理后键合的微流控芯片，使芯片更加牢固，可以更好的防止漏水问题。
5.本发明实现了两种直径相近的白血病细胞oci和thp-1的连续分离，并对thp-1细胞实现了单细胞捕获。
附图说明
图1为本发明实施例的整体结构示意图；
图2为本发明实施例的分体结构示意图；
图3为本发明实施例的侧视图；
图4为本发明实施例的俯视图；
图5为本发明实施例中捕获结构的结构示意图；
图6为本发明实施例中的电极对的结构示意图；
图7为为本发明实施例中上捕获层和下捕获层的结构示意图；
图8为使用本发明进行细胞分离的工作示意图。
图中，1-基底，2-细胞捕获器，3-电极对，4-微流通道，5-细胞捕获阵列，6-样品入口，7-第一样品出口，8-第二样品出口，9-u形柱，10-圆柱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
如图1-图7所示，本发明一种集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片，包括基底1和细胞捕获器2，基底1上溅射有电极对3，细胞捕获器2上设有一个样品入口6和两个样品出口7,8，细胞捕获器2包括上捕获层和下捕获层，上捕获层和下捕获层对准键合后形成细胞捕获阵列5和微流通道4，细胞捕获阵列5包括多个同形的单细胞捕获结构，每个单细胞捕获结构包括u形柱9和圆柱10，u形柱9与上捕获层相连，圆柱9与下捕获层相连，样品入口6贯穿上捕获层后与微流通道4的首端相连，微流通道4经过电极对2后分两路，每路与一个细胞捕获阵列5的前端相连，与细胞捕获阵列5后端相连的微流通道4与贯穿上捕获层的样品出口7,8相连。基底1所用的材料为玻璃。
电极对3中包括十对梯形微电极和插指微电极，梯形微电极的长度为200μm，宽度为40μm，高度为200μm，相邻梯形微电极之间的间隔是40μm。
样品入口6的直径为100μm，样品出口7,8包括第一样品出口7和第二样品出口8，第一样品出口7的直径为100μm，第二样品出口8的直径为120μm。
相邻两个单细胞捕获结构的前后间距为80μm，u形柱9和圆柱10的上下间距为50μm，u形柱的弯角处直径为45μm，开口处的宽度为70μm，u形柱9的u形口的宽度为15μm，圆柱10的端面直径为60μm。
细胞捕获器2所用的材料为pdms。样品为thp-1细胞和oci细胞的混合细胞悬液。
芯片的制作方法
以下制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而不是对本发明的材料、尺寸和制作方法做出限定。
微流控芯片的微电极以玻璃为基底，利用溅射法制作微电极。在玻璃片上溅射金属铂之前先溅射一层金属钛，可以使金属铂与玻璃基底更牢靠不易脱落。金属溅射的工艺流程，可以分为清洗、匀胶、前烘、曝光、后烘、显影、溅射钛、溅射铂和乙醇剥离。
（1）清洗：将玻璃片先放入丙酮溶液中超声清洗5min，随后放入乙醇溶液中超声震荡清洗5min，最后用去离子水超声清洗5min，用氮气将其吹干，在设定温度为100℃的加热板上加热1min。
（2）匀胶：设定匀胶机转速为500r/min的低速10s，2500r/min的高速30s，在玻璃片表面旋涂一层厚度为2μm的正胶（rzj304）。
（3）前烘：设置温度为100℃的加热板，将匀好正胶的玻璃片加热1min。
（4）曝光：将掩膜版与光刻正胶表面距离设置为100μm、曝光剂量为43mj/cm2，把匀有正胶的ito导电玻璃放入光刻机中来完成曝光工艺。
（5）后烘：将加热板的温度设置为100℃，把曝光过后的玻璃片放在加热板上加热1min。
（6）显影：把玻璃片放在正胶显影液（rzx-3038）中显影，显影时间为35s，之后用去离子水洗净，氮气吹干。
（7）溅射钛：将靶材金属钛和玻璃片放入高分辨率磁控离子溅射镀膜仪中，溅射10nm厚的的钛。
（8）溅射铂：将靶材换成金属铂，在溅射完钛的玻璃片上溅射100nm的金属铂。
（9）乙醇剥离：将溅射完成的玻璃片，放入乙醇溶液中超声清洗30min，取出，并用去离子水清洗，氮气吹干。
本芯片具有单细胞捕获结构的微流通道是利用高聚物材料聚二甲基硅氧烷(pdms)制作完成的。一般采用模塑法来加工微流通道和单细胞捕获结构，用光刻法制作出以硅片为基底的阳模具，浇注配比搅拌好的液态高分子材料，最后固化剥离。主要制作工艺步骤为匀胶、前烘、曝光、后烘、匀胶、前烘、曝光、后烘、显影、浇注固化和剥离。
（1）清洗：把硅片放入稀硫酸和双氧水的溶液中超声清洗5min，再放入去离子水中超声清洗5min，用氮气吹干，备用。
（2）匀胶：将光刻负胶（su8-2007）用低速500r/min旋涂10s，高速3000r/min旋涂30s，旋涂在硅片表面负胶的厚度约为10μm。
（3）前烘：设置加热板的温度为65℃，将匀过负胶的硅片水平放在加热板上加热1min后，将加热板的温度升高至95℃，加热3min。
（4）曝光：把先前制作好的菲林掩膜版放入光刻机中，将上捕获层结构光刻在硅片负胶表面。
（5）后烘：同之前的前烘一样，在65℃的加热板上加热1min，之后在95℃的加热板上加热3min，此时，光刻的上捕获层结构和对准标记能够显现并观察出来。
（6）匀胶：用胶带纸将对准标记粘住，选用低速500r/min旋涂10s、高速6000r/min旋涂30s，在之前的负胶（su8-2007）上旋涂一层厚度约为30μm负胶（su8-2050）。
（7）前烘：将匀过负胶（su8-2050）后的硅片四周胶带纸拭去，露出对准标记，将加热板温度设置为65℃加热2min，之后将温度升高至95℃，继续加热5min。
（8）曝光：将绘制有微流通道和下捕获层结构图案的掩膜版放入光刻机内，将硅片上的对准标记与掩膜版上的对准标记对齐，光刻微流通道和下捕获层结构。
（9）后烘：设置加热板设置为65℃，加热光刻后的硅片2min，然后将加热板升至95℃并加热5min，为了防止由于温度的骤然升降将使光刻负胶表面产生皱褶或者裂缝，要将硅片自然冷却至室温。
（10）显影：配制su8显影液将后烘完成的硅片放置其中显影5min，留下微流通道和单细胞捕获结构，之后用去离子水洗净，氮气吹干，备用。
（11）浇注固化：把pdms预聚物与固化剂按照10:1的比例搅拌均匀，静置5min后抽真空，当气泡完全消失后得到未完全固化的液态pdms聚合物。随后将其浇注于含有单细胞捕获结构和微流通道的硅片上，抽真空10min，用来除去未完全固化的液态pdms聚合物中的气泡。最后放置于加热板上以温度90℃加热1小时，便可完成pdms的固化工作。
（12）剥离：将已经固化成型的pdms从硅片上剥离出来，与所制作的微流控芯片微电极大小进行对比，用刀片将pmds划成合适大小，若与微电极键合可以将电极焊盘露出来；最后还需要在微流通道的入口和出口处完成打孔，备用。
（13）将具有微电极那面的玻璃与具有微流通道那面的pdms材料朝上，一起放入等离子键合机（pdc-32g-2）内进行30s表面改性处理。用过氧等离子气体处理过的pdms材料表面和玻璃片表面若在空气中暴露太久，表面出现的极性基团将会消失，因此对准过程需要迅速完成，若是使用显微镜手动来进行对准，很可能会因对准操作过程耗时过长极性基团消失。本发明的微流通道因为尺寸较窄，需要精确对准，所以需要借助光刻机来完成对准键合，用透明胶带将有微电极的玻璃基底固定在光刻机显微镜的载物台上，然后将pdms材料制作的微流通道粘贴在光刻机械平台的上方，通过调整旋钮控制光刻机的机械平台进行方向调节，使pdms材料制作的微流通道与玻璃基底进行对准。
（14）对准之后，调节机械平台使pdms材料制作的微流通道与玻璃基底键合在一起，实现初步键合。之后将实现初步键合的微流控芯片放在90℃的加热板上加热5min，完成键合的最后一步。
芯片的工作过程
采用以下方法将本发明应用于人体白血病细胞的分选和捕获。此方法为了便于本领域技术人员理解本发明的功能，并不是对本发明的适用范围做出限定。
如图8所示，thp-1细胞和oci细胞是人急性髓细胞性白血病细胞。
（1）hoechst荧光染色剂染thp-1细胞的细胞核，激发蓝色荧光；cfda-se荧光染色剂染oci细胞的细胞核，激发绿色荧光。从样品入口6注入含有这两种细胞的混合细胞悬液。
（2）从电极对3施加电压幅值为20v、频率为5mhz的交流信号，在1.5μl/min的流速情况下，thp-1细胞受正介电泳力较大，一部分向第一样品出口7偏转，一部分仍向第二样品出口8流出；分离提纯后的thp-1细胞流入捕获结构区域，在斯托克斯拖曳力作用下被捕获。oci细胞在此条件下也受正介电泳力的影响，但是没有thp-1细胞受正介电泳力的影响大，oci细胞绝大部分都从第二样品出口8流出，由第一样品出口7收集到的thp-1细胞分离纯度高达94.89%。
尽管已经参照其示例性实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域的技术人员应该理解，在不脱离权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节上的各种改变。