本发明属于基因工程检测技术领域，尤其涉及检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术：
目前，转基因作物的品种和产量正在迅速增长：欧盟基本禁止了转基因作物的种植，但进口、加工、销售较多，如玉米、油菜、大豆、甜菜均在市场流通和食用；美国大量种植、生产和销售大豆、玉米、棉花等多种转基因作物。我国农业部批准发放了7种转基因作物安全证书，分别是耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米、抗虫水稻，每种转基因作物均包含若干具体获证品系，并允许种植、生产、加工、销售。
油菜(brassicanapusl.)在我国无商品化转基因品系种植。2004年起，我国农业部给予安全证书(进口)的有monsanto的gt73(rt73)和bayer的ms1×rf1、ms1×rf2、ms8×rf3、t45(hcn28)、oxy-235、topas19-2(hcn92)共7个品系，其中t45(hcn28)、topas19-2(hcn92)为抗草铵膦性状，oxy-235为抗溴苯腈性状。据相关报道，从2013年起，每年有上百万吨转基因菜籽油进口我国，多来源于加拿大。在加拿大，油菜种植中80％左右为转基因品系，而转基因品系中95％以上为抗除草剂品系，按种植比例依次为monsanto公司gt73(rt73)抗草甘膦品系约46％、bayer公司ms8×rf3抗草铵膦品系约31％、pioneerhi-bred公司ns抗咪唑啉酮系列约15％。由于转基因油菜在种植上优势明显，因而转基因菜籽油相对国内非转基因菜籽油在市场价格上便宜20％以上。
我国《食品安全法》规定，生产经营转基因食品应当按照规定显著标示，由消费者自由选择。目前，pcr技术是检测和鉴定转基因产品的主流方法，通过对样品提取dna以检测某外源基因，从而判定样品是否含有该转基因成分。
油菜产品包括油菜植株、油菜籽粕和菜籽油。油菜植株和油菜籽粕含有大量细胞组织，按照常规方法可通过自动化的核酸提取仪或商品化的提取试剂盒获取dna，不再冗述。目前油菜产品的dna提取重点和难点在于菜籽油dna提取。菜籽油主要成分为油脂，dna残留量极低，如果按照核酸提取仪或提取试剂盒通常为1ml的取样量进行提取，几乎无法获取到能达到检出限的dna量；如果将取样量放大到l级，又会因为无法适用核酸提取仪或提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。目前，各检测单位通常采用增大取样量，用自制试剂进行手动提取的方法来获取dna，这些方法种类广泛、区别很大，导致操作较复杂，检测结果的重复性较差，不利于规范化操作。
油菜相关产品的dna检测，目前以pcr技术为主要技术手段。第一代pcr技术，通常称为普通pcr技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品dna和引物及扩增试剂混匀后通过pcr仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。
第二代pcr技术为实时定量荧光pcr，通常简称荧光pcr。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光pcr仪(通常简称荧光pcr仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通pcr，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。
多重实时定量荧光pcr(以下简称多重荧光pcr)属于荧光pcr的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光pcr仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光pcr，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。
涉及转基因成分检测的pcr技术，已有较广泛的报道，但多为普通pcr方法。多重荧光pcr方法在转基因成分检测方面的应用较少，涉及转基因大豆和转基因番茄等，具体包括：专利申请201410843991.x《转基因大豆gts40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量pcr检测引物组和方法》、专利申请201310248783.0《利用四重荧光定量pcr检测番茄转基因成分的方法》、专利申请201410033119.9《一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量pcr检测方法和检测试剂盒》等。
现有技术并未报道检测油菜转基因成分的多重荧光pcr方法，已报道的大豆转基因和番茄转基因的检测等，与油菜转基因成分的检测在样品提取、核心引物和探针序列及荧光标记等方面存在显著的差异。因此，提供一种检测油菜产品转基因成分的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及方法具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明将油菜产品转基因品系的内源基因、转基因通用元件外源功能基因同时用于设计特异性的引物探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于转基因成分的充分检出。同时，本发明给出了菜籽油的样品dna提取方法，该法简单高效，可作为上述转基因成分的检测基础，适于我国食品检测以终端产品为主的实际情况。
油菜植株或油菜籽粕等未加工品、粗加工品、副产品含有大量的细胞组织，可按照常规方法进行提取，如核酸提取仪、商品化试剂盒等。菜籽油主要成分为油脂，dna残留量极低，发明人经多次试验发现现有的常规提取方法已不适用。
本发明发现，对于菜籽油，核酸提取仪、商品化试剂盒等取样量在100μl至1ml，其中dna含量几乎无法达到检出限；若增大取样量至l级，又会因为无法适用核酸提取仪、提取试剂盒的运行规范而导致难于操作。同时，核酸提取仪、商品化试剂盒等核心技术为利用磁珠、柱膜等吸附dna后，先进行杂质洗涤、再溶解洗脱获得dna样品；在此过程中，吸附、洗涤、洗脱等环节，dna损失量大，对后续检测更为不利。
本发明进一步发现，一些文献或专利采用常用于植物和真菌的ctab法提取菜籽油，原因在于传统的ctab法使用相关自制试剂(如蛋白酶k、ctab抽提液、苯酚/氯仿/异戊醇、醋酸钠/异丙醇/乙醇等)和简单器材(如移液器、离心机等)，可根据样品量灵活调整试剂用量和操作过程，可用于提取油脂中dna。但存在ctab易沉淀、苯酚和氯仿作为强三致试剂用量较大(ml级)、异丙醇沉淀及乙醇洗涤步骤对人员经验积累和操作能力要求极高等缺点。
本发明根据菜籽油生产工艺，推断其经深加工后dna已成游离状态，通过大量试验发现ctab抽提液主要成分中ctab(溶解细胞膜、沉淀蛋白质和酸多糖)、nacl(提供高盐环境)和辅助成分中β-巯基乙醇(抗氧化、去除酚类)、pvp(去除多糖和酚类)及蛋白酶k(裂解细胞膜、降解蛋白质)等试剂已不是必需成分。因此用te缓冲液替代ctab抽提液萃取dna，其主要成分tris-hcl(ph＝8.0，提供缓冲环境，有稳定作用)和edta(螯合剂，螯合mg2+和mn2+以抑制dnase活性)更适宜萃取菜籽油中dna。
本发明根据菜籽油几乎所有成分均为油脂的特点，在使用ph＝8.0的te缓冲液进行dna萃取过程中，加入相对菜籽油取样量略过量的正己烷，与油脂和其他有机相互溶，后续通过分液漏斗与te缓冲液进行有机相/水相分离，可代替ctab法中通过苯酚/氯仿分离有机相/水相的过程。综上，将ctab法中先提取后分相的两个过程的操作简化为一个萃取兼分相的过程，具有操作简便、环境友好的优点。
本发明根据菜籽油基因组含量极低的特点，首先尝试大体积植物dna提取试剂盒对分离到的te缓冲液提取dna，发现试剂盒以磁珠、柱膜等为核心技术，通过吸附、洗涤、洗脱等环节，虽然去除了以色素为主的各种杂质，但dna损失量较大，已无法达到荧光pcr要求检出量；其次尝试ctab法中醋酸钠、异丙醇、乙醇对dna的洗涤、沉淀过程，发现由于dna含量极低，在肉眼无法察觉任何沉淀的情况下进行洗涤和沉淀操作，对人员经验积累和操作能力要求极高，不利于日常检测和推广应用；最后使用真空浓缩仪结合dna浓缩管对分离到的te缓冲液进行直接浓缩，可将水相从18–25ml过夜浓缩至0.4–2ml，后将此0.4–2ml水相通过dna浓缩管浓缩至50–100μl，即可上机检测。相对ctab法中醋酸钠/异丙醇/乙醇的繁琐精细的洗涤/沉淀过程，上述操作基本由仪器完成，仅有2–3次吸取转移水相操作，简单方便，提高了操作的准确性。
同时，本发明考虑到上述提取过程虽非常简易，但实际检测中仍有部分实验人员操作粗糙、不慎带入较多杂质的情况，此时则加入等体积的活性磁珠于基因组提取液中进行dna吸附，70％酒精(v/v)洗脱两次，再用50–100μl的te洗脱获得纯化后的基因组提取液。
本发明根据菜籽油基因组提取液中色素等杂质含量较高的特点，在进行后续荧光pcr检测时，使用适于环境样品的荧光pcr试剂，尽可能抑制色素等杂质对pcr扩增和荧光信号造成的干扰，并使用其最大的dna提取液上样量，可将所测目的基因的ct值稳定在34–38区间，符合绝大部分标准中ct值<40要求。
本发明在设计检测油菜产品转基因成分的引物和探针时，首先检索油菜(brassicanapusl.)内源基因，确定对accg8、crua、pe3-pepcase基因设计引物和探针进行检测。检索ncbi的genbank后分别获得相关序列数十条，首先用lasergenev7.1.0中的megalign软件比对出保守序列，通过oligov7.0.1和ncbi的primer-blast验算后进行筛选，分别设计出一套引物和探针。相对农业部2031号公告-9-2013《转基因植物及其产品成分检测油菜内标准基因定性pcr方法》、sn/t1201-2014《饲料中转基因植物成分pcr检测方法》中探针长度在25bp和30bp以上，探针仅为20bp以下，特异性更强。此外，选用nfq-mgb荧光淬灭基团，相对tamra、bhq等特异性更强，能有效避免单碱基差异带来的非特异性扩增，确保鉴定结果准确。
本发明在设计油菜内源基因的引物探针后，其次检索转基因油菜品系：目前商品化的主要有monsanto公司gt/rt系列、zsr系列，bayer公司的ms、rf、phy、hcn系列，pioneerhi-bred公司的45/46a系列、ns系列，calgene的23系列等。商品化种植的主要有monsanto公司gt73(rt73)抗草甘膦品系、bayer公司ms8×rf3抗草铵膦品系、pioneerhi-bred公司ns抗咪唑啉酮系列。2004年起，我国农业部给予安全证书(进口)的有monsanto的gt73(rt73)和bayer的ms1×rf1、ms1×rf2、ms8×rf3、t45(hcn28)、oxy-235、topas19-2(hcn92)共7个品系，其中t45(hcn28)、topas19-2(hcn92)为抗草铵膦品系，oxy-235为抗苯腈品系。
本发明根据相关文献和资讯报道，目前进口我国的菜籽油成品，基本在上述获颁安全证书(进口)的品系范围内。经检索发现，其转基因通用元件均含有camv35s、fmv35s、nptii、nos中的一种或多种，外源功能基因均含有bxn、bar、pat、epsps、gox中的一种或多种。由于camv35s、fmv35s、nptii、nos几乎被运用于所有转基因植物品系，本发明选用其通用的引物和探针序列。
对bxn、bar、pat、epsps等转基因油菜品系所特有的功能基因，检索ncbi的genbank后分别获得相关序列数十条，首先用lasergenev7.1.0中的megalign软件比对出保守序列，通过oligov7.0.1和ncbi的primer-blast验算后进行筛选，分别设计出一套引物和探针。此外，在ncbi上检索发现，外源功能基因gox不同序列之间差异较大，大部分为对土壤中耐药性菌群的研究结果，不适用于本申请目的；随后通过cnki进行文献检索，发现文献(苏丹.草甘膦氧化还原酶基因转化油菜的研究[d].呼和浩特:内蒙古大学,2008.)中报道的gox基因序列源于转基因油菜，并通过大量试验筛选，确定了少数gox基因序列可适用于本发明油菜产品转基因成分检测的目的，据此设计一套引物和探针。
上述引物和探针，相对农业部869、953、1193、2031、2259号公告中关于转基因油菜的普通pcr方法和荧光pcr方法更为简便高效；相对sn/t1201-2014《饲料中转基因植物成分pcr检测方法》中探针长度多在30bp左右的情况，探针均在20bp以下，特异性更强。此外，同样选用nfq-mgb荧光淬灭基团提高特异性。
accg8、crua、pe3-pepcase、bxn、bar、pat、epsps、gox的引物探针组检测位点举例如下：
(1)accg8源于油菜的乙酰辅酶a羧化酶基因(acetyl-coacarboxylasegene)，检测位点如ncbi的genbank中x77576.1的889至1009bp。
(2)crua源于油菜的储藏蛋白芸薹素基因(cruciferinagene)，检测位点如ncbi的genbank中xm022701322.1的1392至1515bp。
(3)pe3-pepcase源于油菜的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(phosphoenolpyruvatecarboxylasegene)，检测位点如ncbi的genbank中d13987.1的582至675bp。
(4)bxn基因源于臭鼻杆菌(klebsiellaozaenae)的腈水解酶基因(nitrilasegene)，检测位点如ncbi的genbank中eu099578.1的335至446bp。
(5)bar基因源于土壤吸水链霉菌streptomyceshygroscopicus的双丙氨膦抗性基因(bialaphosresistancegene)，检测位点如ncbi的genbank中ky886895.1的4172至4269bp。
(6)pat基因源于解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens的草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)，检测位点如ncbi的genbank中jx139720.1的345至486bp。
(7)epsps基因源于根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)的5-莽草酸-3磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene)检测位点如ncbi的genbank中ab209952.1的38至200bp。
(8)gox基因源于苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)的草甘膦氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene)，检测位点如文献(苏丹.草甘膦氧化还原酶基因转化油菜的研究[d].呼和浩特:内蒙古大学,2008.)中543至636bp位点。
本发明根据菜籽油基因组含量低、碎片化的特点，不限定必需按照如下的常规植物转基因成分检测顺序：内源基因阳性(阴性即判断为未检出该植物dna)——通用元件阳性(阴性即判断为未检出转基因成分)——功能基因阳性(判断为相应品系)或功能基因阴性(判断为无法确定品系)。建议在菜籽油转基因成分的实际检测中，根据内源基因、通用元件、功能基因的检测结果综合结论。
本发明提供的检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr引物探针组如下：
表1引物探针对照表
本发明还提供检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr试剂盒，包括上述的引物探针组、荧光pcr试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照。在配套试剂选择上，对于多重荧光pcr试剂，除具有前述适于环境样品的特点，尽可能抑制色素等杂质对pcr扩增和荧光信号造成的干扰；也应具有带热敏taq抗体且包括rox染料，热敏taq抗体可抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，延长试剂盒保存时间、允许更多的冻融次数；同时对于需要rox染料的多重荧光pcr仪可提升检测准确性。
优选地，上述上有引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/l。
优选地，所述阳性对照为用上述引物探针组中包含的上游引物和下游引物进行扩增，并用上述引物探针组中包含的探针组检测的混合dna片段或基因组，浓度为105copies/μl级。
优选地，所述阴性对照为非转基因和油菜源性dna；所述空白对照为3dh2o。
此外，本发明还提供检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr方法，包括如下步骤：
1)对油菜产品进行提取，得到基因组提取液；
2)采用所述的四重荧光pcr试剂盒构建反应体系，反应条件为：95℃20–120s或10–15min；95℃5–60s，60℃20–120s；40cycle并收集荧光信号，根据扩增循环数进行油菜转基因成分检测结果的判断。
优选地，所述油菜产品为菜籽油，基因组提取液用量为所述的荧光pcr试剂的最大限量。
优选地，所述步骤1)包括如下步骤：
①取3.5l菜籽油，加入4l正己烷，混匀后，再加入40ml的ph＝8.0的te缓冲液，200rpm速率摇6h或过夜；
②静置，用分液漏斗将有机相和水相分层，用离心管收集水相；
③4℃下10000rpm离心10min，注意不要吸取沉淀和上层油脂，移取水相至新的离心管，重复本步骤1次，得到分离后的水相；
④将所述分离后的水相装载至真空浓缩仪在45℃、15torr条件下浓缩20-28h，得到浓缩液，浓缩液的体积为0.4–2ml；
⑤将所述浓缩液转移至dna浓缩管，用离心机在500g反复离心浓缩至终体积50-100μl，得到基因组提取液。
优选地，所述检测结果的判断包括：
①质控标准：阳性对照的accg8、crua、pe3-pepcase、bxn、camv35s、fmv35s、nptii、nos、bar、pat、epsps、gox均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，ct值≥40.0，则进行②油菜产品成分检测。
②样品accg8或/和crua或/和pe3-pepcase检测阴性，表明该样品中不含油菜dna或含量不足以检测和判定；样品accg8、crua和pe3-pepcase分别检测阳性，表明该样品中含有油菜产品dna，则进行③转基因成分检测。
③样品bxn或/和camv35s或/和fmv35s或/和nptii或/和nos或/和bar或/和pat或/和epsps或/和gox检测ct值≥40.0，表明该样品中不含相应的油菜产品转基因成分；样品bxn或/和camv35s或/和fmv35s或/和nptii或/和nos或/和bar或/和pat或/和epsps或/和gox检测ct值≤30.0，表明该样品中含有相应的油菜产品转基因成分；样品bxn或/和camv35s或/和fmv35s或/和nptii或/和nos或/和bar或/和pat或/和epsps或/和gox检测30<ct值<40.0，复检后如果ct值≥40.0，表明该样品中不含相应的油菜产品转基因成分，复检后如果ct值<40.0，表明该样品中含有相应的油菜产品转基因成分。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明针对选定的油菜内源基因和外源基因设置引物探针组，各引物探针不会造成相互干扰，仅扩增特定基因并激发荧光信号，特异性好、灵敏度高。
(2)本发明提供的检测方法有利于油菜产品转基因成分的充分检出，相对多重pcr方法具有标准误差更小(标准3kbp质粒初始浓度为105级时，定量标准误差在104级)、检测时间更短(上机1h左右出具检测结果)、产生有毒有害物质更少(荧光染料用量为ng/μl级)的优点；相对荧光pcr方法具有同时检测多个目标基因、节约试剂成本的优点；相对普通pcr方法，兼具上述两种优点。
(3)本发明提供的菜籽油中dna提取方法，简便高效、操作简单，目的基因的荧光pcr测定ct值稳定在34–38之间，适于我国食品检测以终端产品为主的实际情况。
(4)本发明提供的引物、探针、试剂盒和方法已应用于本单位的日常检测中(检出限0.01％质量分数)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同；实践表明，本发明相对标准方法节约操作时间75％左右、节约试剂成本75％左右，具有较好的应用价值。
附图说明
图1本发明实施例三的荧光pcr扩增曲线图；其中1至24、25至36、37至48、49至96分别为accg8等12个基因的阳性对照、样品初检结果、样品复检结果、阴性和空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的试剂和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。
实施例一检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr试剂盒的构建及验证
①引物探针组：如表1所示，可通过具有引物和探针合成能力的公司合成，本实施例选择上海生工生物工程技术服务有限公司合成，将引物和探针干粉稀释至200μmol/l作为储备液，按照表2配制成10μmol/l作为使用液，并用黑色1.5ml离心管在-20℃储存。
表2100μmol/l储备液配制为10μmol/l使用液
②荧光pcr试剂：常见市售环境样品荧光pcr试剂，本实施例选择abi
③阳性对照：取全部引物储备液，分别稀释至10μmol/l。提取转基因油菜标准品dna，用对应引物和普通pcr试剂在普通pcr仪上进行扩增，将目的条带切胶回收后转入takarat-vectorpmdtm20载体，用感受态e.coli细胞jm109复制，提取pmt-20质粒，分别稀释至106copies/μl级浓度，各取10μl混匀后用3dh2o定容至100μl，终浓度即为105copies/μl级。
④阴性对照：非转基因且非油菜源性dna。
⑤空白对照：3dh2o。
⑥多通道荧光pcr仪选用abiquantstudio5，验证样品特征如表3、按表4进行反应液配制、按表5进行反应。
表3样品特征
表430μl反应体系(单位：μl)
表5反应条件
注*：检测荧光信号。
⑦反应结果如表6所示：
表6样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线
⑧验证结果：将试剂盒送至省内同行业检测单位的微生物(含分子生物学)检测实验室，结果一致。通过阳性对照、加标对照、阴性对照、空白对照的设置，表明试剂盒成分有效，且特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本。
实施例二省级食品安全监督抽查样品——油菜植株、油菜籽粕的检测
调取省抽样品油菜植株、油菜籽粕，分别编号为#1、#2样品。将样品球磨粉碎后使用外购dna提取试剂盒(qiagenmagattracthmwdnakit)在小型磁力架(qiagenmagattractmagneticrack)上提取样品dna，均用3dh2o稀释(或真空浓缩)至50ng/μl左右浓度，引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，外购的荧光pcr试剂为
检测结果见表7：①质控标准：阳性对照的accg8、crua、pe3-pepcase、bxn、camv35s、fmv35s、nptii、nos、bar、pat、epsps、gox均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，ct值≥40.0。②样品accg8、crua、pe3-pepcase有荧光信号和对数增长且ct值≤30.0，表明该样品中含有油菜dna。③样品bxn、camv35s、fmv35s、nptii、nos、bar、pat、epsps、gox无荧光信号和对数增长，表明该样品未检出转基因成分。④比对结果：与按照sn/t1197-2016《油菜中转基因成分检测普通pcr和实时荧光pcr方法》对样品进行油菜转基因成分检测的结果相符。
表7样品检测结果：实测ct值及有无s型曲线
实施例三国家监督抽查风险检测样品——菜籽油的检测
调取国抽样品中菜籽油一份，标签显示为转基因菜籽油，样品量5l，按下述步骤提取dna：
①取3.5l菜籽油，加入4l正己烷，混匀后，再加入40mlph＝8.0的te缓冲液，于空气摇床中以200rpm速率摇6h或过夜；
②静置，用分液漏斗将有机相和水相分层，用离心管收集水相，体积36ml；
③用冷冻离心机在4℃下10000rpm离心10min，注意不要吸取沉淀和上层油脂，移取水相至新的离心管，重复本步骤1次，得到分离后的水相；
④将所述分离后的水相装载至真空浓缩仪在45℃、15torr条件下浓缩24h，得到浓缩液，浓缩液的体积为1.0ml；
⑤将浓缩液转移至dna浓缩管，用离心机在500g反复离心浓缩至终体积100μl，得到基因组提取液。
外购的荧光pcr试剂选择环境样品优化试剂abitaqmantmenvironmentalmastermix2.0，菜籽油dna提取液上样量选择最大值12μl。引物针组、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例一中的试剂盒成分，上机检测(abi荧光pcr仪，型号为quantstudio5)。
检测结果见图1和表8：①质控标准：阳性对照的accg8、crua、pe3-pepcase、bxn、camv35s、fmv35s、nptii、nos、bar、pat、epsps、gox均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和荧光对数增长，ct值≥40.0。②样品accg8、crua、pe3-pepcase检测30<ct值<40，复检后ct值<40，表明该样品中含有油菜dna。③样品bxn、camv35s、fmv35s、nptii、nos、bar、pat、epsps、gox检测30<ct值<40，复检后ct值<40，表明该样品检出相应转基因成分。④比对结果：与按照sn/t1197-2016对样品进行油菜转基因成分检测的结果相符。
表8样品检测结果：实测ct值
序列表
<110>贵州省产品质量监督检验院
<120>检测油菜产品转基因成分的四重荧光pcr引物探针组、试剂盒及方法
<160>36
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>1
tatctatgtagccaagaaatcctc24
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>2
actgtatagagcacgcatc19
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>3
accgtccaacataatgggtca21
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>4
caaacgcacagatcaacaca20
<210>5
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>5
atcgtgttgaacttaaccc19
<210>6
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>6
caagaccgaggttcgtcca19
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>7
tgaaagaaacttctcgacct20
<210>8
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>8
aataacaagaaaggcaaaacga22
<210>9
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>9
acttgttccacggatactccc21
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>10
attattgctcgggtagatcg20
<210>11
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>11
cactgataatgagaagattagcct24
<210>12
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>12
tcttgatgagacctgctgcgta22
<210>13
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>13
cgacagtggtcccaaaga18
<210>14
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>14
aagacgtggttggaacgtcttc22
<210>15
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>15
tggacccccacccacgaggagcatc25
<210>16
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>16
aagacatccaccgaagactta21
<210>17
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>17
aggacagctcttttccacgtt21
<210>18
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>18
tggtccccacaagccagctgctcga25
<210>19
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>19
aggatctcgtcgtgacccat20
<210>20
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>20
gcacgaggaagcggtca17
<210>21
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>21
cacccagccggccacagtcgat22
<210>22
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>22
atcgttcaaacatttggca19
<210>23
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>23
attgcgggactctaatcata20
<210>24
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>24
catcgcaagaccggcaacagg21
<210>25
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>25
ggcccctggaaggcacgcaa20
<210>26
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>26
tagagcgtggagcccagtcccgtc24
<210>27
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>27
gcagcccgatgacagcgacca21
<210>28
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>28
ggacagagccacaaacacca20
<210>29
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>29
tcgtaagcgttcctagcct19
<210>30
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>30
aacaccctcaacctcagcaaccaa24
<210>31
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>31
cgataaaggaaaggccatcgttg23
<210>32
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>32
ttgtgcgtcatcccttacgtca22
<210>33
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>33
aagatgcctctgccgacagt20
<210>34
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>34
taacttgtctcacgcctttacca23
<210>35
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>35
acgacgaaacaagagagtcac21
<210>36
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(rengongxulie)
<400>36
acaccatcaacccacaaggtct22