本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种促根抗盐的碳氮磷协同菌群的筛选及协同菌剂的制备与应用。
背景技术：
目前，我国盐渍化土地的面积高达1.8亿亩，且呈逐年递增的趋势。以设施蔬菜土壤为例，其表层土壤中盐分的含量是露地的7.9倍，设施菜田土壤盐分的总量上升了69.3%。土壤盐化已严重阻碍了作物的生长和种植业的可持续发展。因此，如何提高作物耐盐性是促进我国种植业良性发展的面临的重要问题之一。
淡水资源短缺是限制我国农业发展的一个重要因素。特别是黄淮海流域，水资源仅占全国8%，而耕地占40%，农业用水极度缺乏。为了缓解淡水资源危机，被动采用咸水灌溉已成为黄淮海流域多数地区不可避免的现实问题。但是，持续微咸水灌溉极易导致次生盐渍化和作物减产。因此，如果在微咸水灌溉区域提高作物耐盐性也是亟待解决的重要问题之一。
在盐分累积下，一方面，土壤中的养分，特别是氮和磷，往往处于失效状态而难以被作物根系吸收利用；另一方面，盐分占比增大而碳库占比下降，表现出明显的高盐低碳趋势。土壤碳库，特别是有机碳，不仅是土壤有机质的重要表征，而且是微生物发挥其功能的重要调节者；而有机质和微生物对调控作物生长有十分重要的作用。因此，提升土壤碳库占比是阻控盐渍化需首要解决的问题。其次，利用根际微生物与根系的协同促生效果，不仅可以通过活化土壤养分促进根系对养分的吸收，同时可以提高根系抗逆性且改善根系生长。
我国有9900多万公顷的盐碱地。虽然大多数作物不能在盐碱地上生存，但一些耐盐性野生植物在历史的长河中存活、适应并繁衍后代。在长期的自然选择过程中，盐碱地野生植物根际微生物不断进化，并很好地适应了盐碱环境。在这些盐碱地野生植物的根际微生物群落中，存在一些可潜在的提高作物耐盐性的微生物种群。
现有的提高作物根系耐盐性的微生物菌剂及其制备方法多集中在耐盐性菌株的筛选上，但往往忽略了植物根系氮、磷、碳吸收的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要提供一种能够提高作物耐盐性及促进根系吸收的促根抗盐的碳氮磷协同菌群的筛选方法；
还有必要提供一种促根抗盐的碳氮磷协同菌剂的制备方法；
还有必要提供一种促根抗盐的碳氮磷协同菌剂的应用。
一种促根抗盐的碳氮磷协同菌群的筛选方法，包括以下步骤：
采集样品：采集盐碱地野生植物的根系样品；
制备固态微生物接种原料：将采集到的盐碱地野生植物的根系样品利用微生物活性保持型缓冲液进行冲洗，并将冲洗得到的根系样品悬浮液进行离心过滤，得到离心沉淀和上清液，将得到的上清液放置于无菌的微孔膜中进行真空抽滤，然后将带有微生物的微孔膜用无菌剪刀剪成碎片，放入至上述离心沉淀的离心管中，与离心沉淀混合后制得固态微生物接种原料；
筛选异效碳源利用型协同抗盐菌群：将得到的固态微生物接种原料分成两份，分别接种在专化高盐缺碳液体培养基中，其中一份培养基中添加生物活性碳，另外一份添加生物惰性碳，筛选出异效碳源利用型协同抗盐菌群；
筛选促根抗盐的碳氮磷协同菌群：将筛选出的异效碳源利用型协同抗盐菌群接种到专化溶磷缺氮液体培养基中，筛选出促根抗盐的碳氮磷协同菌群；
优选的，在所述制备固态微生物接种原料步骤中使用的微生物活性保持型缓冲液的配方为：磷酸氢二钾0.6618克、磷酸二氢钾0.1633克、硫酸镁0.1克、氯化钠6.5克、无菌水1升、ph7.0。
优选的，在所述筛选异效碳源利用型协同抗盐菌群步骤中使用的专化高盐缺碳液体培养基的配方为：磷酸氢二钾1.5886克、磷酸二氢钾0.3919克、二水氯化钙0.06克、七水硫酸镁0.48克、一水硫酸锰2.52克、七水硫酸亚铁0.014克、七水硫酸锌0.35克、五水硫酸铜0.35克、硼酸0.35克、二水钼酸钠0.065克、硫酸铵1.704克、氯化钠25克、去离子水1升、ph7.0。
优选的，在所述筛选异效碳源利用型协同抗盐菌群步骤中一份培养基中添加的生物活性碳由质量比为1:1的小麦和玉米秸秆组成，添加量为1.3克/升，一升的培养基中添加1.3克的生物活性碳源，所述的生物惰性碳为生物碳，其添加量为5克/升。
优选的，所述筛选促根抗盐的碳氮磷协同菌群步骤中使用的专化溶磷缺氮液体培养基的配方为：葡萄糖12克、磷酸钙5.5克、七水硫酸镁0.2克、六水氯化镁4.5克、氯化钾0.25克、1.0毫升微量元素溶液、2.05%edta铁盐溶液5毫升、1.0毫升维生素溶液、氢氧化钾4.5克、去离子水1升、ph7.0；
优选的，所述1.0毫升微量元素溶液具体包括五水硫酸铜0.1克、七水硫酸锌2.5克、硼酸2.6克、二水钼酸钠2.0克、硫酸锰2.5克、去离子水1.0升；所述1.0毫升维生素溶液具体包括生物素10毫克、盐酸吡多醛20毫克、去离子水100毫升。
一种促根抗盐的碳氮磷协同菌剂的制备方法，将筛选出的促根抗盐的碳氮磷协同菌群与微生物活性保持载体混合制备出促根抗盐的碳氮磷协同菌剂。
优选的，所述微生物活性保持载体的配方为每100克总载体中含有10克小麦秸秆、10克玉米秸秆、20克生物炭、50克花生饼粉、9.18克棉粕、0.5克蛋白胨、0.3克葡萄糖、0.02克七水硫酸镁。
一种促根抗盐的碳氮磷协同菌剂的应用，将制备得到的促根抗盐的碳氮磷协同菌剂在蔬菜育苗和栽培定植中根据需要添加，蔬菜育苗中的添加量为基质质量的6%；在作物定植后，以果类蔬菜黄瓜和番茄为例，该菌剂的施用量为400公斤/亩。
本发明采用上述技术方案，其有益效果在于：本首先筛选出促根抗盐的碳氮磷协同菌群，接着将筛选出的促根抗盐的碳氮磷协同菌群制备成促根抗盐的碳氮磷协同菌剂并应用到作物生长中，改变现有的提高作物根系耐盐性的微生物菌剂及其制备方法仅集中在耐盐性菌株的筛选而忽略了微生物碳、氮、磷协同吸收的问题；
本方法首先将采集到的盐碱地野生植物的根系样品用活性保持型缓冲液进行清洗得到根系微生物样品悬浮液，然后将根系微生物样品悬浮液采用离心沉淀和微孔膜截留联合法收集根际微生物样品并制成固态微生物接种原料；接着利用专化高盐缺碳液体培养基及生物活性和惰性碳源，筛选出固态微生物接种原料中的异效碳源利用型协同抗盐菌群；进一步利用专化溶磷缺氮液体培养基，筛选出异效碳源利用型协同抗盐菌群中的耐盐的碳氮磷协同菌群；将耐盐的碳氮磷协同菌群与微生物活性保持载体混合，制备出可促根抗盐的碳氮磷协同菌群固态制剂。该方法在同步实现调碳、固氮和溶磷的基础上，通过碳氮磷协同，促进作物根系的抗盐性并改善其生长。
此外，采用添加目标碳源的专化高盐缺碳液体培养基，可将不具备耐盐性能的微生物直接排除筛弃，直接将高效抗盐且只利用目标碳源的微生物协同菌群筛选出来；同时，采用生物活性碳和生物惰性碳分别作为碳源，直接筛选异效（生物活性和惰性）碳源利用型协同抗盐菌群，增加了这些菌群在不同碳源环境中的适应性，并大幅提高它们的应用范围；
利用专化溶磷缺氮液体培养基，直接将异效碳源利用型协同抗盐菌群中具有固氮和溶磷功能的菌群筛选出来，最终保留了促根抗盐的碳氮磷协同菌群，并将促根抗盐的碳氮磷协同菌群与微生物活性保持载体混合，制备出促根抗盐的碳氮磷协同菌群固态制剂应用到作物生长中，在同步实现调碳、固氮和溶磷的基础上，通过碳氮磷协同，促进作物根系的抗盐性并改善其生长，从而大幅提高了这些菌群在盐化土壤和微咸水灌溉土地中的应用效果。
该方法兼顾考虑了影响耐盐微生物利用效果的四个关键因素，即土壤碳库占比的恢复及其对微生物的重要调控作用、微生物菌剂与根系的亲和性、微生物菌剂活性在作物根区的持久性和根区失效养分的活化。
附图说明
图1为三种样品的促根抗盐的碳氮磷协同菌群生物学测序结果。
图2为三种样品制得的促根抗盐的碳氮磷协同菌剂对黄瓜苗根系生长的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施实例，对本发明进行进一步说明。但是，应当理解，此处描述的具体实例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
（1）采集样品：
准备工作：将采集样品所需的铁锹和剪刀在浓度为0.3-0.5%的次氯酸钠或次氯酸钙中浸泡60min，然后无菌水冲洗2次，以实现铁锹和剪刀的灭菌；
采集样品：用一个灭菌的铁锹将野生植物的整个根系沿根区边界挖出，抖落掉所有能轻易抖落的土壤，然后用一个无菌剪刀从距离根尖2-5cm剪断根系，将所有的带有根尖的根系集中放置在一个自封袋中，然后将自封袋放在一个装有冰袋的泡沫盒中；用此方法从宁夏一块盐碱地中，分别采集了野生柽柳（cl）、结缕草（jlc）和碱蓬（jp）的根系样品；
洗脱根际土样：分别取采集到的野生柽柳（cl）、结缕草（jlc）和碱蓬（jp）的根系样品中，微生物活性高的根系样品5克放入50毫升的塑料离心管中，并对离心管进行种类标记，然后在三个离心管中分别加入25毫升微生物活性保持型缓冲液，将离心管密封后放置在摇床上震荡1小时，震荡时的转速为280转/分钟；将震荡后的根系从离心管内取出得到根系样品悬浮液，然后将三种样品的根系样品悬浮液进行离心过滤，离心转速为5000转/分钟，时间为5分钟，得到离心沉淀和上清液；将得到的上清液放置于无菌的微孔膜中进行真空抽滤，无菌微孔膜的直径为5厘米，孔径为0.2微米，真空抽滤后微生物被截留在微孔膜上，将截留有微生物的微孔膜用无菌剪刀剪成碎片，截留微生物微孔膜碎片的直径3毫米，然后放入盛装离心沉淀的离心管中，与离心沉淀混合后分别制得三种样品的固态微生物接种原料；
微生物活性保持型缓冲液的配方为：磷酸氢二钾0.6618克、磷酸二氢钾0.1633克、硫酸镁0.1克、氯化钠6.5克、无菌水1升、ph7.0；
（2）筛选菌群：将上述制得的三种样品的固态微生物接种原料每一个样品分成两份，分别按1%的量接种在专化高盐缺碳液体培养基中，其中一份培养基中添加生物活性碳，生物活性炭由小麦和玉米秸秆质量比1:1组成，添加量为1.3克/升，1升的培养基中添加1.3克的生物活性炭，另外一份培养基中添加生物惰性碳，即生物碳，其添加量为5克/升，将两份培养基分别在有氧条件下悬浮震荡6天，以6天后的混合菌液为接种液，其余原料和过程不变，继续悬浮培养震荡6天；继续重复这一步骤2次，筛选出异效碳源利用型协同抗盐菌群；选用小麦和玉米秸秆、生物惰性碳作为筛选异效碳源利用型协同抗盐菌群的碳源，相较于蔗糖等碳源能够提高筛选菌群的活性；
专化高盐缺碳液体培养基的配方为：磷酸氢二钾1.5886克、磷酸二氢钾0.3919克、二水氯化钙0.06克、七水硫酸镁0.48克、一水硫酸锰2.52克、七水硫酸亚铁0.014克、七水硫酸锌0.35克、五水硫酸铜0.35克、硼酸0.35克、二水钼酸钠0.065克、硫酸铵1.704克、氯化钠25克、去离子水1升、ph7.0；
（3）制备菌剂：将上述筛选出的每一个样品的异效碳源利用型协同抗盐菌群，按1%的量接种在专化溶磷缺氮液体培养基中，有氧条件下悬浮震荡6天；以6天后的混合菌液为接种液，其余原料和过程不变，继续悬浮培养震荡6天；继续重复这一步骤2次，筛选出促根抗盐的碳氮磷协同菌群；将促根抗盐的碳氮磷协同菌群与微生物活性保持载体混合，促根抗盐的碳氮磷协同菌群添加量为载体混合物最大持水量的85-95%，最终制备出三种样品的促根抗盐的碳氮磷协同菌剂；
专化溶磷缺氮液体培养基的配方为：葡萄糖12克、磷酸钙5.5克、七水硫酸镁0.2克、六水氯化镁4.5克、氯化钾0.25克、1.0毫升微量元素溶液、2.05%edta铁盐溶液5毫升、1.0毫升维生素溶液、氢氧化钾4.5克、去离子水1升、ph7.0；所述1.0毫升微量元素溶液具体包括五水硫酸铜0.1克、七水硫酸锌2.5克、硼酸2.6克、二水钼酸钠2.0克、硫酸锰2.5克、去离子水1.0升；所述1.0毫升维生素溶液具体包括生物素10毫克、盐酸吡多醛20毫克、去离子水100毫升。
（4）菌剂应用：
首先对每一个样品的促根抗盐的碳氮磷协同菌群进行了分子生物学测序鉴定，随后，采用促根抗盐的碳氮磷协同菌剂，进一步检测了其对黄瓜幼苗根系生长的影响试验。
图1为促根抗盐的碳氮磷协同菌群生物学测序结果；
图2为促根抗盐的碳氮磷协同菌剂对黄瓜苗根系生长的影响；
将实施例获得的促根抗盐的碳氮磷协同菌群，利用分子生物学手段进行了测定如图1，结果表明，三种盐碱地野生物植物根系样品中的促根抗盐的碳氮磷协同菌群种类均较丰富，其中，cl以叶杆菌（phyllobacteriaceae）、根瘤菌（rhizobiaceae）和莫拉菌（moraxellaceae）为主；jlc以假单胞杆菌（pseudomonadaceae）和aurantlmonadaceae为主；jp以假单胞杆菌（pseudomonadaceae）和莫拉菌（moraxellaceae）为主；三种不同野生物植物根系促根抗盐的碳氮磷协同菌有差异，但两两之间有叠加，存在共性。
将三种样品的促根抗盐的碳氮磷协同菌剂在黄瓜育苗中分别以基质质量的6%的量接种到黄瓜苗中，在黄瓜苗定植后，以400公斤/亩的量施入黄瓜地中，对三种样品的菌剂对黄瓜苗根系生长的影响进行了测定，与对照相比，如图2，三种促根抗盐的碳氮磷协同菌剂均显著提升了黄瓜幼苗根系长度，包括总根长、主根长和侧根长；与对照相比，cl、jlc和jp处理下的黄瓜总根长分别提高了90.3%、113.0%和126.7%；主根长分别提高了38.4%、61.0%和88.8%；侧根长分别提高了641.9%、665.7和528.6%。
上述实例的试验结果表明，本发明不仅提供了一种协同高效、精准量化且简便易行的促根抗盐的碳氮磷协同菌群固态制剂的有效制备方法，同时制备的菌剂具有良好的促进根系生长的效果。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。