本发明涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种ncpbvdv单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus,bvdv)属于黄病毒科瘟病毒属。bvdv感染对养牛业造成巨大经济损失，是养牛业所面临的最重要的疾病之一。
按照病毒在细胞培养过程中是否对细胞引起病变，将病毒分成致细胞病变型（cytopathicbvdv，cpbvdv）和非致病变型(noncytopathic，ncpbvdv)。ncpbvdv能够通过胎盘传播，而导致胎儿持续性感染（persistentlyinfection,pi）。pi牛终生带毒而成为重要传染源。cpbvdv感染细胞可以引起典型的细胞病变，因而可以通过测定半数细胞培养物感染量（tcid50）测定病毒滴度。而ncpbvdv感染细胞不能引起典型的细胞病变，不能通过测定tcid50而确定该病毒滴度，这极大的制约了对该病毒抗病毒药物的研发和致病机制的分子机理研究，建立测定ncpbvdv病毒滴度的方法对于该病毒抗病毒药物研发和对该病毒的基础研究都具有重要意义。
迄今国外有多个实验室建立了ncpbvdv病毒滴度测定和用于抗病毒药物筛选的体系，如将gfp报告基因插入bvdv基因组内构建，携带gfp的重组病毒，用流式细胞仪进行抗病毒药物筛选；采用荧光定量pcr测定病毒基因组拷贝数等，利用单克隆抗体或多抗血清建立的免疫荧光技术。
然而，现有方法均耗时耗力，研究成本高，依赖于大型仪器，不适合用于大规模抗病毒药物筛选。因此，亟需一种简单可靠的方法用于测定ncpbvdv滴度，以期用于抗病毒药物高效筛选。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种ncpbvdv单克隆抗体及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
制备一种ncpbvdv单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链型为：lgg1，轻链型为：kappa型。
优选的，所述单克隆抗体的ipma效价不低于1.02×106。
提供一种ncpbvdv单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）采集携带bvdv的疑似患牛血液，分离ncpbvdv病毒；
（2）将所述分离的ncpbvdv病毒接种牛肾细胞，制备ncpbvdv免疫抗原；
（3）以所述制备的ncpbvdv免疫抗原免疫小鼠；
（4）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得ncpbvdv单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产所述ncpbvdv单克隆抗体。
优选的，在所述步骤（2）中，所述ncpbvdv病毒的接种量为1：101～108。
进一步的，所述ncpbvdv病毒的接种量为1：500。
优选的，在所述步骤（2）中，所述牛肾细胞感染所述ncpbvdv病毒的感染时间为12h或24h。
将所述的ncpbvdv单克隆抗体在抗病毒药物高通量筛选中应用。
提供一种抗ncpbvdv药物筛选的方法，包括以下步骤：
（1）接种细胞：将mdbk细胞接种于96孔板内培养至细胞密度接近90%；
（2）药物预处理细胞：将抗病毒药物用dmem稀释后加入96孔板内培养1h，弃去上清；
（3）稀释病毒及药物：利用dmem培养基将bvdv病毒稀释，然后用稀释的病毒液来稀释抗病毒药物；
（4）细胞感染病毒：去96孔板培养基上清，加入含有药物的病毒液培养1h，弃去上清，用pbs洗后，加入含有不同浓度的抗病毒药物dmem培养基，继续培养至12h；
（5）配制细胞固定液：每10ml甲醇中加入100μl30%h2o2，混合均匀；
（6）固定细胞：将所述步骤（4）中96孔板的细胞上清去掉，加入所述步骤（5）配制的细胞固定液，作用10min，pbst清洗；
（7）封闭：5%猪血清室温下作用1h，弃去封闭液；
（8）一抗作用：用所述ncpbvdv单克隆抗体，按照1：1000稀释于5%猪血清中，加入96孔板内作用60min，pbst洗3次，每次间隔5分钟；
（9）二抗作用：hrp标记的羊抗小鼠igg，用封闭液1：500稀释后，加入96孔板内作用60min，pbs洗3次，每次间隔5分钟；
（10）显色：按照说明配制aec显色液，加入96孔板内作用1～5min，双蒸水洗3次；
（11）显微镜下观察每孔细胞被染色情况；
（12）利用imagej软件统计感染阳性细胞数，计算抑制率；
（13）按照所述抑制率的大小筛选有效抗病毒药物。
优选的，在所述步骤（2）中，抗病毒药物用dmem稀释后的浓度为0.1～100μm。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明成本低，不依赖于大型仪器；与荧光定量pcr相比，本发明无需反转录和pcr等步骤，从而能够显著降低成本，易于在生产和科研中推广和应用。
2.本发明的方法特异性强：本发明专利是基于特异性单克隆抗体而建立的方法，具有较强的特异性，可用于家畜病毒诊断与抗病毒药物高通量筛选。
3.本发明的操作简便快速：与荧光定量pcr相比，没有反转录等步骤，染色完毕后可以立即观察，并初步定性判断结果。
4.本发明显示检测结果直观准确：病毒感染的细胞被特异染色而呈红褐色，在普通显微镜下即可观察和定量统计，无需借助荧光显微镜等容易产生非特异性染色的观察方法，被染色后的细胞可以长期保存便于后续追踪比较研究，操作快速、简单，与荧光定量pcr等方法相比显著降低了科研成本和对荧光显微镜等贵重仪器的依赖，易于在科研和临床诊断中广泛应用推广。
附图说明
图1为不同病毒接毒量和感染时间的细胞显微镜图；
图2为不同通浓度利巴韦林药物的细胞显微镜图；
图3为不同通浓度利巴韦林药物对病毒抑制率的柱形图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：ncpbvdv单克隆抗体的制备
1.ncpbvdv病毒分离
（1）采集bvdv疑似患牛血液，无菌分离血清，将血清加入青链霉素4℃作用1小时；
（2）加入mdbk细胞中，37℃co2培养箱内作用2小时；
（3）加入培养基，继续培养48小时，反复冻融2次，12000rpm/min离心去掉细胞碎片；
（4）利用mdbk细胞进行盲传感染48小时，同样方法复盲传3代；
（5）利用商品化单抗进行免疫荧光检测和pcr进行鉴定，确定病毒为bvdv。
2.ncpbvdv免疫抗原的制备。
（1）以上述分离的ncpbvdv接种牛肾细胞（mdbk），48～60小时收取病毒培养液；
（2）4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kda超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩；
（3）以sepherose4fastflow琼脂糖凝胶柱对病毒进行凝胶过滤层析纯化；
（4）采用免疫荧光法测定病毒的tcid50达10-7以上，荧光定量pcr测定纯化病毒拷贝数达1010以上。
3.ncpbvdv单克隆抗体的制备。
（1）杂交瘤细胞株的建立。
a.将纯化的ncpbvdv与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50g～100g/只免疫balb/c系小鼠3次，每次间隔15～30天；
b.第3次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；
c.剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；
d.将1×108的脾细胞与2～5×107的sp2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清；
e.在37℃的水浴中将0.7～1ml的40%～50%peg4000（ph8.5～9.0）缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止peg的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于hat选择培养基中，并加入96孔培养板，置37℃5%co2培养箱中培养；
f.培养7～10天后，取杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性杂交瘤细胞。
筛选阳性杂交瘤细胞的具体步骤如下：
以ncpbvdv感染mdbk胞，24小时候经甲醇固定，5%猪血清37℃封闭1h；加待检细胞培养上清50μl/孔，设hat培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加1：500辣根过氧化物酶（hrp）标记羊抗小鼠igg抗体(购于jackson，货号：115-035-003，下同)（50μl/孔），37℃作用30min；每步反应后均用含0.05%tween-20的pbs充分洗涤；以底物aec室温显色1～5min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。
选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，建立单克隆抗体杂交瘤细胞株6株，其中选择19a3h8进行后续试验。
（2）单克隆抗体19a3h8腹水的制备
以体内诱生腹水制备单抗。
取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞107个/只，7d～10d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
（3）单克隆抗体19a3h8腹水中igg效价的测定
a.以ncpbvdv感染mdbk胞，24h经甲醇固定，5%猪血清37℃封闭1h；
b.加入不同稀释度的腹水（1:100，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000）100μl/孔，以异种单抗为阴性对照；
c.室温下作用1h，用pbst(含0.05%tween-20的pbs)洗3次，间隔5min/次；
d.加1：500辣根过氧化物酶（hrp）标记羊抗小鼠igg抗体（50μl/孔），37℃作用30min；
e.每步反应后均用含pbst充分洗涤；
f.以底物aec室温显色1～5min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。
结果该腹水1：1000稀释，对病毒感染细胞显著染色而无背景。
ncpbvdv单克隆抗体19a3h8的重链型为：lgg1型，轻链型为：kappa型；ipma检测19a3h8的效价为：1.02×106。
实施例二：病毒感染量和感染时间的优化试验
（1）接种细胞：将mdbk细胞接种于96孔板内，在含有5%co2，37℃培养箱内过夜培养，次日细胞密度接近90%；
（2）稀释病毒：将实施例1中分离的ncpbvdv病毒从10-1至10-3递增稀释；
（3）细胞感染病毒：将96孔板内培养基上清去掉，加入不同稀释度的病毒液，100μl/孔，在含有5%co2，37℃培养箱内培养1h，弃去上清，用pbs洗2次后，加入新鲜的含有2%马血清的dmem培养基，继续培养至12h和24h；
（4）配制细胞固定液：每10ml甲醇中加入100μl30%h2o2，混合均匀；
（5）固定细胞：将步骤（3）中收集的细胞上清去掉，加入步骤（4）配制的细胞固定液，100μl/孔，室温下作用10min，pbs洗1次；
（6）封闭：5%猪血清室温下作用1h，弃去封闭液；
（7）一抗作用：用实施例1中bvdv单克隆抗体19a3h8腹水，按照1：1000稀释于5%猪血清中，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用60min，pbs洗3次，每次间隔5分钟。
（8）加入二抗：hrp标记的羊抗小鼠igg，用封闭液1：500稀释后，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用60min，pbs洗3次，每次间隔5分钟；
（9）显色：按照说明配制aec显色液，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用1～5min，双蒸水洗3次；
（10）显微镜下观察和拍照：采用20×目镜观察每孔细胞被染色情况，于上下左右四个方向分别拍照各一张，其中每张照片中感染阳性细胞数目在100～200，作为感染量和感染时间的优化标准，可以借助imagej软件辅助统计感染阳性细胞数。
（11）确定病毒接种量和感染时间。
结果如图1所示：选择病毒接毒量为1：500稀释、感染时间为12h时，
在该条件下，染色后病毒感染的细胞多数为单个，而不是呈片状分布，一方面便于后续细胞计数，另一方面该阶段病毒颗粒聚集于细胞内，或者释放于细胞外的较少，而感染邻近细胞后复制的病毒子较少而难以检测出，这种情况下便于分析药物对病毒感染的抑制作用。
实施例三：抗病毒药物筛选试验
（1）接种细胞：将mdbk细胞接种于96孔板内，在含有5%co2，37℃培养箱内过夜培养，次日细胞密度接近90%；
（2）药物预处理细胞：将抗病毒药物利巴韦林用dmem稀释成0.1μm，1μm，10μm，100μm，加入96孔板内，100μl/孔，在含有5%co2，37℃培养箱内培养1h，弃去上清；
（3）稀释病毒及药物：利用dmem培养基将bvdv病毒1：500稀释，然后用稀释的病毒液来稀释抗病毒药物，分别为0.1μm，1μm，10μm，100μm；
（4）细胞感染病毒：将96孔板内培养基上清去掉，加入含有药物的病毒液（不加药物的做阳性对照），100μl/孔，在含有5%co2，37℃培养箱内培养1h，弃去上清，用pbs洗2次后，加入新鲜的含有不同浓度的利巴韦林dmem培养基（0.1μm，1μm，10μm，100μm），继续培养至12h；
（5）配制细胞固定液：每10ml甲醇中加入100μl30%h2o2，混合均匀；
（6）固定细胞：将步骤（4）中96孔板的细胞上清去掉，加入步骤（5）配制的细胞固定液，100μl/孔，室温下作用10min，pbst洗1次；
（7）封闭：5%猪血清室温下作用1h，弃去封闭液；
（8）一抗作用：用用实施例1中bvdv单克隆抗体19a3h8，按照1：1000稀释于5%猪血清中，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用60min，pbst洗3次，每次间隔5分钟；
（9）二抗作用：hrp标记的羊抗小鼠igg，用封闭液1：500稀释后，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用60min，pbs洗3次，每次间隔5分钟；
（10）显色：按照说明配制aec显色液，加入96孔板内，100μl/孔，室温下作用1～5min，双蒸水洗3次；
（11）显微镜下观察拍照：采用20×目镜观察每孔细胞被染色情况，于上下左右四个方向分别拍照各一张，bvdv感染阳性的细胞被染色为红褐色；
（12）抑制率统计方法：利用imagej软件辅助统计感染阳性细胞数，按照如下公式计算抑制率：
抑制率=[（阳性对照组bvdv红色细胞数目-药物处理组红色细胞数目）/阳性对照组红色细胞数目]×100%
抑制率越高说明药物抑制作用越显著。
如图2所示：
病毒感染的细胞经不同浓度的利巴韦林处理，被抗体染色的细胞数随着利巴韦林浓度的增加，感染细胞数量逐渐减少，所以利巴韦林抑制病毒复制具有剂量依赖性，由此可见该方法适合于检测利巴韦林抗病毒药物作用。
如图3所示：
病毒感染的细胞经不同浓度的利巴韦林处理，采用荧光定量pcr分析病毒滴度，由结果可见随着利巴韦林浓度的增加，对病毒感染的抑制率逐渐增加，所以利巴韦林抑制病毒复制具有剂量依赖性，抑制趋势与本发明的免疫染色方法结果（图2）一致。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。