细胞膜动态功能化的方法与流程

本发明属于生物化学技术领域，尤其是涉及一种细胞膜动态功能化的方法。

背景技术

细胞膜作为细胞结构上的边界——由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成，不仅是维持细胞与周围相对独立环境的天然屏障，也是保证细胞与周围环境进行复杂物质、能量、信息交换的智能门户。细胞膜本身就是一项难以媲美的复杂、精密、动态、有序又无序的分子工程。细胞膜结构的动态性及生物功能特性为细胞膜大分子工程提出的挑战是共性的关键技术问题。由于细胞结构始终处于动态变化中，构筑不够充分容易被细胞直接内吞，过度构筑又容易导致意料之外的细胞功能伤害，甚至凋亡。尽管如此，科研工作者的努力不断克服困难，发展了系列策略。

最近，langer在前瞻性综述中预测“livingbiomaterials”将成为未来发展方向。此外，细胞膜大分子工程有望回答诸多细胞应用相关技术瓶颈问题。因此，无论从基础还是应用研究的角度考虑，自然与人工工程的联姻凸显重大科学与技术价值。目前，细胞膜工程在调控细胞疫原性、迁移性、粘附性，提高细胞抗恶劣环境能力，控制细胞代谢，装配人工受体，组装细胞群，辅助刺激细胞功能，清除环境重金属，诱导干细胞分化，功能分子递送等方面取得较大进展。目前细胞膜工程化主要思路是利用细胞膜的物化属性，主要包括细胞膜的负电性，蛋白富含的羧基、氨基、巯基，对细胞膜进行结构修饰，以期达到调控行为的目的(expbiolmed.2016；241:1098-106)。基于阳离子高分子与荷负电细胞膜的静电作用进行包覆的方法使用较多，相对较成熟。例如基于静电吸附，在细胞表面沉积聚赖氨酸与抗坏血酸高分子层，及明胶与海藻酸钠层(chemnanomat.2016；2:376-84.)。该策略效率高，可精确控制高分子层数，但受限于阳离子高分子本身的毒性，难以发挥更大影响。基于羧基氨基缩合反应，巯基与马来酰亚胺基团的加成反应进行化学修饰也被广泛使用。例如，利用胰岛细胞表面氨基与活性酯反应在胰岛细胞表面修饰上peg层，可帮助抑制其免疫反应，有利于胰岛移植的成功。

为应对一些极端环境(热、干燥、辐射、化学等)，芽孢杆菌会临时形成一层坚固的保护性胞芽，主要由肽聚糖构成。胞芽会之后瓦解，细菌重新回到正常生理状态。(accountschemres.2016；49:792-800)细胞膜大分子工程也可起到类似保护作用，然而，较少研究对如何瓦解进行针对性设计。这关系完成工程使命后的“善后”问题——避免细胞膜上人工结构持续存在的影响。这在很多场合下至关重要，因为多数时候调控是暂时性的。例如，通过干细胞表面工程调控干细胞分化并不希望分化后携带工程所引入的材料。靶向递送中，细胞趋化靶向组织后也希望表面携带的功能材料脱落渗入组织发挥作用。

技术实现要素：

针对上述瓦解进行针对性设计，本发明提出一种细胞膜动态功能化的方法，本发明基于二硫键与细胞膜表面共价键合，对其细胞膜进行动态功能化。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种细胞膜动态功能化的方法，反应活性高的二硫化物质，在生理环境下，与细胞膜表面巯基发生高效的交换反应，对细胞膜进行动态功能化，获得细胞膜被材料工程化的细胞。

所述反应活性高的二硫化物质选择以下物质中的一种或多种：

(1)只含有自由巯基的物质，与具有活化巯基的物质活化反应后，形成的反应活性高的二硫化物质；

(2)不含自由巯基但含有二硫键的物质，经可打断二硫键的物质打断二硫键，获得自由巯基，再与具有活化巯基的物质活化反应后，形成的反应活性高的二硫化物质；

(3)同时含有自由巯基和二硫键的物质，与具有活化巯基的物质活化反应后，形成的反应活性高的二硫化物质。

所述含有自由巯基的物质包括大分子化合物或小分子化合物；

所述不含自由巯基但含有二硫键的物质包括大分子化合物或小分子化合物；

所述同时含有自由巯基和二硫键的物质包括大分子化合物或小分子化合物；

大分子化合物包括蛋白质等物质。大分子化合物或小分子化合物可以为一些含有功能性的化合物。

所述只含有自由巯基的物质是指含有2个或2个以上自由巯基的物质。

所述可打断二硫键的物质包括但不局限于二硫苏糖醇(dtt)或谷胱甘肽等。

所述具有活化巯基的物质包括5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)等。

所述细胞膜来自于人或动物的表面富含巯基的肿瘤细胞、干细胞、免疫细胞或淋巴细胞等。

交换反应的进行时间可在2小时以内完成，不使用任何有毒害物质，快速高效。

进行交换反应后，还包括去除反应活性高的二硫化物质的过程。

本技术方案具有良好生物相容性，不影响细胞正常生理功能。

本发明所使用的反应活性高的二硫化物质，可在数天内，被细胞自行吸收，因此可避免对细胞功能的长期影响。

本发明可保持细胞正常生理功能的同时，对细胞进行多水平调控，包括增殖、周期、内吞效率等方面。

本发明还涉及采用上述方法得到的细胞膜工程化的细胞。

以使用蛋白材料为例进行更详细的说明：通过对蛋白质进行三维结构调控，还原处理暴露巯基，并在巯基上修饰离去能力较强的官能团，得到巯基活化蛋白质。活化蛋白质可高效通过与多种细胞膜上巯基形成二硫键对细胞表面进行改性，并可利用剩余活化基团与巯基化蛋白质形成二硫键连续多次组装工程化。整个方法的可行性得到证实，且过程绿色、条件温和、反应快速、工程化效率高。

与现有技术相比，本发明对细胞膜进行功能化过程适用于不同细胞类型，整个过程具有很高细胞相容性，且所使用的反应活性高的二硫化物质在一段时间后可以自行降解，有效避免对细胞功能的长期影响。该技术可暂时调控细胞的功能如增殖，周期，内吞效率，在细胞命运及功能调控上具有广泛应用前景。

附图说明

图1为实施例中所使用牛血清白蛋白工程化b16细胞前(a)后(b)的扫描电镜图片。

图2为实施例中使用fitc标记白蛋白后对b16细胞膜不同时间孵化膜工程化后的激光共聚焦图片，细胞核用dapi染色。

图3为实施例中应用工程化技术促进难入胞物质(葡聚糖)的入胞效率。采用流式技术定量葡聚糖分析入胞量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1.将含有1个自由巯基和17个二硫键的牛血清，通过加入一定量的sds，促进蛋白暴露疏水区域，然后加入适量的dtt将打断二硫键，获得含有自由巯基的白蛋白。

2.将适量活化的蛋白与目标细胞-b16细胞相互作用20min～数小时。

3.离心去除过量的材料，洗涤数遍后，获取细胞膜工程化的细胞。

本实施例中所使用牛血清白蛋白工程化b16细胞前、后的扫描电镜图片如图1所示，可以明显看出b16细胞的细胞膜有明显变化。

4.增殖能力分析：cfse标记细胞膜后，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况，结果如图2所示。该原理可用来检测细胞的增殖情况。

5.流式细胞仪定量分析细胞工程化技术促进细胞吞噬效率。以dc2.4为例，将对数生长期的dc2.4细胞离心消化，细胞浓度配置成5×10⁴个/ml。按照每孔5×10⁴个/ml细胞的浓度，将细胞铺至24孔板中，每孔1ml。按前述条件对细胞进行包覆处理。加入荧光标记葡聚糖，孵育不同时间，用facscalibur流式细胞仪，采样分析检测结果，计算各组不同时间的平均荧光强度，结果如图3所示。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。