本发明属于生猪饲养技术领域，具体涉及一种猪生长性状的分子标记方法。
背景技术：
生长速度是影响生猪生产者的经济效益的重要指标，生长速度快的生猪饲养的周期越短，所需要的成本越低，养猪生产者可以获得更高的收入。传统的生猪生长速度的选育是生猪生长到85kg至130kg之间进行逐头测定体重，此时的日龄约150-180天，根据体重计算达100kg体重日龄的育种值，根据育种值大小再进行选留，耗时、耗力、耗资金。
钙结合蛋白（calbindin）是指几种钙依赖性结合蛋白的总称，最初是在鸡和哺乳动物的肾脏和小肠中发现的维生素d-依赖性钙结合蛋白，因钙结合蛋白的手形结构域（ef-hand）与钙结合的数量不同被划分为不同的亚家族，calb2就是其中的一种钙结合蛋白，主要存在于神经组织中。
钙结合蛋白1（calb1），首先在鸡小肠内被发现，接着在哺乳动物的肾脏中发现。它也在许多神经元和内分泌细胞中表达，尤其是在小脑。在体内，钙结合蛋白1（calb1）是由calb1基因编码翻译而成的。calb1含有4个活性钙结合域和2个已失去钙结合能力的修饰结构域。calb1作为钙调节和钙离子传感器，在手形结构域（ef-hand）中可以结合4个钙离子。用高分辨核磁共振技术证实calb1是当时已鉴定的最大蛋白质之一。calb1只有一条链，序列有263个残基。序列主要由α螺旋组成，包含117个残基。calb1在许多组织尤其是鸡的小肠，是一种维生素d应答基因，在介导钙吸收方面具有明显的功能，而在大脑中，它的合成与维生素d无关。calb1和calb3除了钙结合部位手形结构域外没有同源性，calb1有6个手形结构域，而calb3有2个。
钙结合蛋白3主要存在于哺乳动物小肠上皮细胞(肠上皮细胞)中，在一些哺乳动物的肾脏和子宫中也可以发现钙结合蛋白3。在人的体内，钙结合蛋白3是由calb3基因编码翻译而成的。钙结合蛋白3有2个手形结构域，跟钙离子有高亲和力。钙结合蛋白3介导钙从顶端向基底外侧转运，被钙通道调节进入，由钙泵利用胞内三磷酸腺苷把钙送入血液。肠道内钙离子吸收时其通过细胞膜在细胞浆内是限速吸收的；钙结合蛋白的存在不增加游离钙浓度，增加细胞内钙的含量。钙结合蛋白3也可能激活基底外侧钙泵三磷酸腺苷酶。钙结合蛋白3的表达与钙结合蛋白1的表达一样，是由活性维生素d代谢物骨化三醇激活，但其确切的机制仍不明确。维生素d受体不表达的小鼠体内，钙结合素3减少，但不缺失。
钙结合蛋白2（calbindin2，calb2）是钙结合蛋白家族成员之一，与calb1和calb3不同的是，calb2又属于肌钙蛋白c超家族成员，与calb2蛋白有58%的同源性，是由calb2基因编码，猪的calb2基因位于6号染色体上，有11个外显子组成，共编码272个氨基酸。猪calb2基因主要在卵巢、背最长肌、腰大肌和背部脂肪组织中表达。calb2在猪上的研究资料甚少，人的calb2研究结果表明，calb2具有多种细胞功能，如信息靶向和细胞内钙的缓冲作用，calb2还可用于诊断恶性间皮瘤，肺肿瘤和脑肿瘤。钙离子是细胞内最古老、作用最广泛的信号物质，参与调控机体几乎所有的生物学功能，如心脏和肌肉收缩、神经信息传递、学习和记忆、胚胎形成和发育、细胞增殖和凋亡、细胞分裂和分化、细胞能量代谢、蛋白质磷酸化和去磷酸化修饰、基因表达和调控等[9]。
技术实现要素：
为了实现钙结合蛋白2（calb2）基因上游-881bp处的突变体检测，选育生长速度快的猪，本发明提供一种猪生长性状的分子标记。
本发明方法包括猪基因组dna的提取、钙结合蛋白2（calb2）基因上游的扩增引物、体外扩增和基因型检测。
一种猪生长性状的分子标记的操作步骤如下：
（1）提取猪的基因组dna
在仔猪出生当天，采取猪的耳缘组织；从猪的耳缘组织中提取猪基因组dna；
（2）引物设计
在猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间设计1对引物，即上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列如下：
calb2-f上游引物：5’-tggtgttcctctctcccctg-3’
calb2-r下游引物：5’-ccactgtcctctcgtgttga-3’；
（3）聚合酶链式反应
a、配制聚合酶链式反应体系
聚合酶链式反应体系包括上游引物、下游引物、脱氧核苷三磷酸、聚合酶和猪基因组dna，所述猪基因组dna为猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间的核甘酸序列全长为548bp；
b、聚合酶链式反应
进行聚合酶链式反应，得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物，将此扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到calb2扩增产物的凝胶，见图1；
（4）酶切反应
对体外扩增产物进行限制性内切酶酶切反应，得到酶切产物；
（5）多态性（rlfp）检测
对酶切产物进行多态性（rlfp）检测，获得条带aa型为生长速度优良基因型，即突变型，包括548bp一个片段；故选择条带aa型的仔猪留种，条带aa型猪的生长育肥周期缩短3.6～4.0天。
进一步限定的技术方案如下：
步骤（3）中，
a、配制聚合酶链式反应体系
在聚合酶链式反应管中，依次加入4×dntp2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ml、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ml、10u/mltaq聚合酶0.5ml、浓度为100ng/ml的猪基因组dna溶液1ml、含20mmol/l氧化镁(mgcl2)的10×聚合酶链式反应（pcr）缓冲液2.0ml、纯水13.5ml，至终体积20ml；并混合均匀，制得20μl聚合酶链式反应体系；
b、聚合酶链式反应
将20μl聚合酶链式反应（pcr）体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：
①95℃预变性4分钟，
②95℃变性30秒，
③退火温度58℃30秒，
④72℃延伸40秒，
⑤重复第②～④步骤35个循环，
⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物。
步骤（4）中，由于猪calb2基因转录起始位点上游第881位碱基由g突变为a，导致了一个hhai限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是：取5μl猪钙结合蛋白2（calb2）基因转录起始位点上游548bp长的体外扩增产物，分别加入0.5μl浓度10u/μl的hhai限制性内切酶和1μlhhai限制性内切酶缓冲液，加3.5μl水，混匀，温度37℃反应3小时，得到10μl的酶切产物。
步骤（5）中，将5μl所述酶切产物用浓度2.0%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，条带gg型个体为完全切开，包含320bp和228bp两个片段，见图2；条带ga型个体为不完全切开，包括548bp，320bp和228bp三个片段，见图2；条带aa型个体为不能切开，包括548bp一个片段，见图2；其中条带aa型为生长速度优良基因型，即突变型。选择条带aa型的仔猪留种，可以缩短生猪的生长育肥周期，达到提高生猪生长速度的目的。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1、本发明首次发现calb2基因转录位点上游-881位点存在多态性，并与猪生长性状存在着显著相关。鉴于calb2基因在信号传递、胚胎发育、细胞增殖、分化、基因表达等方面具有调控作用，本研究组分析了猪的calb2基因的突变位点，首次发现猪calb2基因5’端上游调控区-881bp处存在着突变位点（g突变为a），导致了一个限制性内切酶hhal的酶切多态性位点，因此在390头大约克夏猪和235头杜洛克猪中检测了群体多态性，并分析了该位点多态性与大约克夏、杜洛克猪的达100kg体重时的日龄性状的关联性，发现该位点与达100kg体重时的日龄存在着极显著相关，大约克夏猪和杜洛克猪的aa型个体比gg型个体分别可以提前4.0天和3.6天出栏，可以作为猪的生长速度性状的分子标记。
2、本发明可以用于猪的育种中对生长性状的辅助选择，实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，运用该基因标记方法可以仅经过一个世代就可以将calb2基因的优良基因型固定下来，即经一个世代的选育即将该基因的生长性状的优良基因达到纯合，而常规育种方法要经过大量的生产性能测定和后裔测定，并且要继代选育5个世代以上才能达到需要的效果，大大缩短了世代间隔，加快选育进程。本发明在仔猪出生时采集耳组织，然后经过dna提取，聚合酶链式反应，酶切等步骤，即可判断每个个体是否具有生长速度快的基因型，选留时间可以提前到仔猪出生后的2周龄以内，大大缩短了选留时间，从而加快选育进程。当前的生猪的全程饲养成本约10元/天，若利用分子标记进行选择可以提前1天出栏，则每头猪自出生至100公斤体重可节约10元成本，出栏1万头猪的猪场，1年可节约10万元，全国生猪年出栏约7亿头，则可节约70亿元的成本，成本效益显著。
3、本发明方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短（548bp），扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。
4、本发明可显著提高猪的生长速度，aa型个体比gg型个体的达到100公斤体重日龄缩短3.6天至4.0天，即可提前3.6~4.0天生长至100公斤体重，明显降低了饲养成本，从而提高经济效益。
附图说明
图1为本发明calb2基因pcr扩增琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明calb2基因上游-881bp年的限制性内切酶（hhai）酶切图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例1：
采集390头大约克夏猪的耳缘组织，同时测定其生长速度，即达100公斤体重日龄。带回实验室，分别进行猪生长性状的分子标记calb2基因的基因型检测，具体操作步骤如下：
（1）提取大约克夏猪的基因组dna
从大约克夏猪的耳缘组织中提取猪基因组dna；
（2）引物设计
在猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间设计1对引物，即上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列如下：
calb2-f上游引物：5’-tggtgttcctctctcccctg-3’
calb2-r下游引物：5’-ccactgtcctctcgtgttga-3’；
（3）聚合酶链式反应
a、配制聚合酶链式反应体系
聚合酶链式反应体系包括上游引物、下游引物、脱氧核苷三磷酸、聚合酶和猪基因组dna，所述猪基因组dna为猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间的核甘酸序列全长为548bp；
配制聚合酶链式反应体系的具体操作如下：在聚合酶链式反应管中，依次加入4×dntp2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ml、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ml、10u/mltaq聚合酶0.5ml、浓度为100ng/ml的猪基因组dna溶液1ml、含20mmol/l氧化镁(mgcl2)的10×聚合酶链式反应（pcr）缓冲液2.0ml、纯水13.5ml，至终体积20ml；并混合均匀，制得20μl聚合酶链式反应体系；
b、聚合酶链式反应
进行聚合酶链式反应，将20μl聚合酶链式反应（pcr）体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：
①95℃预变性4分钟，
②95℃变性30秒，
③退火温度58℃30秒，
④72℃延伸40秒，
⑤重复第②～④步骤35个循环，
⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物，将此扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到calb2扩增产物的凝胶，见图1；
得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物；
（4）酶切反应
对体外扩增产物进行限制性内切酶酶切反应，由于猪calb2基因转录起始位点上游第881位碱基由g突变为a，导致了一个hhai限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是：取5μl猪钙结合蛋白2（calb2）基因转录起始位点上游548bp长的体外扩增产物，分别加入0.5μl浓度10u/μl的hhai限制性内切酶和1μlhhai限制性内切酶缓冲液，加3.5μl水，混匀，温度37℃反应3小时，得到10μl的酶切产物。
（5）多态性（rlfp）检测
对酶切产物进行多态性（rlfp）检测，将5μl所述酶切产物用浓度2.0%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，条带gg型个体为完全切开，包含320bp和228bp两个片段，见图2；条带ga型个体为不完全切开，包括548bp，320bp和228bp三个片段，见图2；条带aa型个体为不能切开，包括548bp一个片段，见图2。
390头大约克夏猪钙结合蛋白2（calb2）基因多态性检测结果，见表1。g等位基因频率为0.45，a等位基因频率为0.55，该猪群在该位点存在着丰富的多态性。
大约克夏猪群钙结合蛋白2（calb2）基因多态性与生长速度的关联分析
记录大约克夏猪自出生至100公斤体重的天数，即达100公斤体重日龄。并分别检测calb2基因的基因型，利用spss13.0软件的一般线性模型（glm）程序对390头的100公斤体重日龄进行最小二乘分析，并对基因效应进行了分析，结果见表2。gg型个体平均达100公斤体重日龄最大为163.2天，大于ga型个体的161.7天，但差异不显著（p>0.05）,gg型个体平均达100公斤体重日龄极显著大于aa型个体（p<0.01），ga型个体平均达100公斤体重日龄显著大于aa型（p<0.05），因此突变型等位基因a为该位点的优良等位基因，突变型aa为该位点生长性状的优良基因型。从基因效应分析看，显性效应均为不完全显性，calb2基因的g等位基因对生长速度（达100公斤体重日龄）表现出正的加性效应，相应突变型等位基因a对生长速度（达100公斤体重日龄）表现出负的加性效应；g等位基因和a等位基因的平均效应值（达100公斤体重日龄）分别为1.128和0.922；a等位基因替代g等位基因的平均效应值为-0.205。大约克夏猪群中aa基因型为优良基因型，a等位基因是优良等位基因，选留aa型猪可有效提高大约克夏猪的生长速度，从而缩短出栏时间，降低饲养成本，按照每头育肥猪每天饲养成本10元计算，则aa型猪比gg型提前4天出栏，则每头猪可节约40元的成本，则一个年出栏1万头的猪场，每年可节约40万元，全国生猪年出栏7亿头生猪，若均缩短4天，则可节约280亿元，经济效益显著。
注：同一行肩标不同字母（a与c）表示差异极显著（p<0.01），标有ab与c表示差异显著（p<0.05）；标有相同字母表示差异不显著（p>0.05）。表中d表示显性效应；a表示基因的加性效应；d表示显性度；α1表示等位基因g的平均效应；α2表示等位基因a的平均效应；α表示a等位基因替代g等位基因的平均效应值（即α2-α1）。
实施例2：
采集235头杜洛克猪的耳缘组织，同时测定其生长速度，即达100公斤体重日龄。带回实验室，分别进行猪生长性状的分子标记calb2基因的基因型检测，具体操作步骤如下：
（1）提取杜洛克猪的基因组dna
从杜洛克猪的耳缘组织中提取猪基因组dna；
（2）引物设计
在猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间设计1对引物，即上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列如下：
calb2-f上游引物：5’-tggtgttcctctctcccctg-3’
calb2-r下游引物：5’-ccactgtcctctcgtgttga-3’；
（3）聚合酶链式反应
a、配制聚合酶链式反应体系
配制聚合酶链式反应体系的具体操作如下：
在聚合酶链式反应管中，依次加入4×dntp2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2ml、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ml、10u/mltaq聚合酶0.5ml、浓度为100ng/ml的猪基因组dna溶液1ml、含20mmol/l氧化镁(mgcl2)的10×聚合酶链式反应（pcr）缓冲液2.0ml、纯水13.5ml，至终体积20ml；并混合均匀，制得20μl聚合酶链式反应体系；
所述猪基因组dna为猪的钙结合蛋白2（calb2）基因起始转录位点的-1201bp至-654bp间的核甘酸序列全长为548bp；
b、聚合酶链式反应
进行聚合酶链式反应，将20μl聚合酶链式反应（pcr）体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下：
①95℃预变性4分钟，
②95℃变性30秒，
③退火温度58℃30秒，
④72℃延伸40秒，
⑤重复第②～④步骤35个循环，
⑥72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存，得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物，将此扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到calb2扩增产物的凝胶，见图1；即得到猪calb2基因转录起始位点上游-1201bp至-654bp间的548bp长的体外扩增产物。
（4）酶切反应
对体外扩增产物进行限制性内切酶酶切反应，由于猪calb2基因转录起始位点上游第881位碱基由g突变为a，导致了一个hhai限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是：取5μl猪钙结合蛋白2（calb2）基因转录起始位点上游548bp长的体外扩增产物，分别加入0.5μl浓度10u/μl的hhai限制性内切酶和1μlhhai限制性内切酶缓冲液，加3.5μl水，混匀，温度37℃反应3小时，得到10μl的酶切产物。
（5）多态性（rlfp）检测
对酶切产物进行多态性（rlfp）检测，将5μl所述酶切产物用浓度2.0%的琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120v，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，条带gg型个体为完全切开，包含320bp和228bp两个片段，见图2；条带ga型个体为不完全切开，包括548bp，320bp和228bp三个片段，见图2；条带aa型个体为不能切开，包括548bp一个片段，见图2。
235头杜洛克猪钙结合蛋白2（calb2）基因多态性检测结果，见表3。g等位基因频率为0.438，a等位基因频率为0.562，该猪群在该位点存在着丰富的多态性，杜洛克猪中该位点处于哈德温伯格平衡状态（p>0.05）。
杜洛克猪群钙结合蛋白2（calb2）基因多态性与生长速度的关联分析
记录235头杜洛克猪自出生至100公斤体重的天数，即达100公斤体重日龄。并分别检测calb2基因的基因型，利用spss13.0软件的一般线性模型（glm）程序对235头的100公斤体重日龄进行最小二乘分析，并对基因效应进行了分析，结果见表4。gg型个体平均达100公斤体重日龄最大为158.3天，大于ga型个体的157.2天，但差异不显著（p>0.05）,gg型个体平均达100公斤体重日龄极显著大于aa型个体的154.7天（p<0.01），ga型个体平均达100公斤体重日龄显著大于aa型（p<0.05），因此突变型等位基因a为该位点的优良等位基因，突变型aa为该位点生长性状的优良基因型。从基因效应分析看，显性效应均为不完全显性，calb2基因的g等位基因对生长速度（达100公斤体重日龄）表现出正的加性效应，相应突变型等位基因a对生长速度（达100公斤体重日龄）表现出负的加性效应；g等位基因的平均效应值（达100公斤体重日龄）为1.060，a等位基因的平均效应值（达100公斤体重日龄）分别为0.826；a等位基因替代g等位基因的平均效应值为-0.234。杜洛克猪群中aa基因型为优良基因型，a等位基因是优良等位基因，选留aa型猪可有效提高杜洛克猪的生长速度，从而缩短出栏时间，降低饲养成本，按照每头育肥猪每天饲养成本10元计算，则aa型猪比gg型提前3.6天出栏，则每头猪自出生至出栏可节约36元的成本，则一个年出栏1万头的猪场，每年可节约36万元，按照2015年以来全国生猪年出栏近7亿头生猪计算，若均缩短3.6天，则可节约252亿元，经济效益显著。
表4中：同一行肩标不同字母（a与c）表示差异极显著（p<0.01），标有ab与c表示差异显著（p<0.05）；标有相同字母表示差异不显著（p>0.05）。表中d表示显性效应；a表示基因的加性效应；d表示显性度；α1表示等位基因g的平均效应；α2表示等位基因a的平均效应；α表示a等位基因替代g等位基因的平均效应值（即α2-α1）。