一种侧向偏移微柱阵列芯片及其应用的制作方法

本发明涉及分离技术领域，尤其涉及一种侧向偏移微柱阵列芯片及其应用。

背景技术

在生物、医学、化学和工业领域中，把物质或颗粒按照尺寸大小进行分离是一种基本的分析手段，常用的方法如过滤、色谱分离、惯性力、涡流和侧向偏移微柱阵列等。在这些技术中，侧向偏移微柱阵列技术，由于具有尺寸精确分离的特点，应用越来越广，侧向偏移微柱阵列的特点是包含布置成列或布置成行的微柱障碍物阵列，每个后续列或者后续行的微柱相对于前一列按照一定角度偏移，根据微柱阵列的尺寸和角度排布，每个微柱阵列有特定的物质临界分选尺寸(直径)，当大于临界直径的大颗粒物质与微柱碰撞后按照阵列的偏移角度方向移动，而小于临界直径的颗粒与微柱碰撞后继续保持原来的流向，大颗粒物质和小颗粒物质因而产生空间分离，已有一些报道在微流控芯片中设计侧向偏移微柱阵列，用以分离血液中的红细胞、白细胞、循环肿瘤细胞和循环胎儿有核红细胞等。

当前在侧向偏移微柱阵列中，微柱横截面的形状包含圆形、三角形、长方形、菱形、“工”字形等连续截面结构，微柱阵列的偏移角度越大，临界分离尺寸(颗粒直径)越小，为获得较大的临界分离尺寸，微柱阵列需用较小偏移角度。在一定的分离通道长度条件下，偏移角度越小，分离通道越窄，窄小的分离通道造成分离通量低，通道易堵塞，因而无法分离大体积样品，限制了基于侧向偏移微柱阵列的设备或芯片的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种侧向偏移微柱阵列芯片及其应用，该侧向偏移微柱阵列芯片中的每一个微柱单元内设有一条或多条通道，当包含不同尺寸大小的颗粒流体经过微柱单元时，流体中尺寸较小的颗粒会流过微柱内部的小通道，而较大尺寸的颗粒则不会流过，并保持原来的流向；这种微柱结构，具有过滤小尺寸颗粒的作用，从而让大尺寸颗粒在进入下一阵列前具有富集效果；在同样的微柱阵列偏移角度下，可减小微柱阵列的临界分离尺寸；在同样的微柱尺寸下，可以用较大的阵列偏移角度取得相同的临界分离尺寸，较大的阵列偏移角度可产生更高的分离通量，分离更大体积的样品。

本发明的第一个目的是提供一种侧向偏移微柱阵列芯片，每个所述微柱单元内设有一个或多个通道。

在本发明的具体实施例中，每个所述微柱单元内可设有1～3个、1个、2个或3个通道。

本发明中，直径小于所述侧向偏移微柱阵列的临界分离尺寸、并且直径小于通道横截面的部分的颗粒能够通过所述通道；直径大于所述侧向偏移微柱阵列的临界分离尺寸的颗粒不能够通过所述通道、并且沿着侧向偏移的方向前行。

对于一种微柱结构，如果高于某一尺寸的颗粒能够全部收集于目标颗粒收集出口，并且小于这一尺寸的颗粒不能全部收集于废液出口，则这一尺寸即为这种微柱结构的临界分离尺寸。

本发明侧向偏移微柱阵列芯片，它的本体包含布置成列或布置成行的微柱障碍物阵列(即侧向偏移微柱阵列)，每个后续列或后续行的微柱单元相对于前一列或前一行按照一定角度偏移。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，所述通道的横截面的最小尺寸可以是微米级别、也可以是纳米级别。在本发明的具体实施例中，所述通道横截面的最小尺寸小于所述侧向偏移微柱阵列的临界分离尺寸。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，所述一个或多个通道中，至少有一个通道的开口方向与所述侧向偏移微柱阵列的偏移方向不同。在本发明的具体实施例中，所述多个通道可共用一个出口。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，所述通道的横截面可为任意规则或不规则的形状；在本发明的具体实施例中，所述通道的横截面可为l形。所述微柱的横截面可为任意规则或不规则的形状；在本发明的具体实施例中，所述微柱的横截面的形状可为三角形、矩形、l形或其它附图所示的不规则的形状。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，每个所述微柱单元由两个或两个以上独立的微柱构成；所述微柱之间的空隙形成所述通道。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，所述微柱单元的尺寸为微米级或纳米级。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，所述芯片可由玻璃、硅和聚合物中的一种或多种制成；所述聚合物可为聚甲基丙烯酸甲酯、双酚a型聚碳酸酯、2,2-双(4-羟基苯基)丙烷聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、环烯烃聚合物和环烯烃共聚物中的至少一种，制备所述环烯烃聚合物和环烯烃共聚物的环烯烃选自环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环丁二烯、环戊二烯和环己二烯的一种或多种。

上述的侧向偏移微柱阵列芯片中，除所述芯片中微柱单元的设计，其结构可采用任意现有的侧向偏移微柱阵列芯片的结构设计；在本发明的具体实施例中，所述芯片包括基片和/或与所述基片密封配合的盖片；所述基片或所述盖片上布置有所述侧向偏移微柱阵列；所述芯片的一端设有用于通入流体样品的进样口和/或用于通入缓冲液的进样口，另一端设有用于收集已经富集的直径大于所述临界分离尺寸的颗粒的目标颗粒出口和用于回收直径小于所述临界分离尺寸的颗粒的废液口。所述侧向偏移微柱阵列在所述基片或所述盖片上可单边布置或双边布置。

本发明的第二个目的是提供利用上述任一项所述的侧向偏移微柱阵列芯片对含有不同尺寸大小颗粒的流体样品进行分离的方法，包括如下步骤：含有不同尺寸大小颗粒的流体样品流经所述侧向偏移微柱阵列，直径大于所述临界分离尺寸的颗粒沿着所述侧向偏移微柱阵列的偏移角度的方向运动，通过目标颗粒收集出口流出收集；直径小于所述临界分离尺寸、并且直径小于所述通道最小尺寸的部分的颗粒经过所述通道，最终保持原流向移动，通过废液口流出；不同尺寸的颗粒产生空间分离，完成所述分离。

本发明的第三个目的是提供上述任一项所述的侧向偏移微柱阵列芯片在下述(1)-(8)中任一项中的应用：

(1)分离外周血样品中的循环肿瘤细胞；

(2)分离胸腔积液、腹水积液、淋巴液、尿液或骨髓样品中的肿瘤细胞；

(3)分离外周血或脐带血样品中的有核红细胞；

(4)分离外周血样品中的循环内皮细胞；

(5)分离外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液、脑脊液或骨髓样品中的白细胞、t细胞、b细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞或造血干细胞；

(6)分离外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液或骨髓样品中的红细胞或血小板；

(7)分离外周血、胸腔积液、腹水积液、尿液、唾液、血浆、血清、脑脊液、精液、前列腺液或阴道分泌物样品中的细菌或病毒；

(8)分离精液样品中的精子。

本发明具有如下有益效果：

本发明侧向偏移微柱阵列芯片中每个微柱单元中设有一个或多个小通道，形成一种新型复合微柱，复合微柱具有分离流体和过滤小尺寸颗粒(颗粒尺寸小于通道宽度)的作用；和连续横截面的单个微柱比，在同样的微柱尺寸和微柱阵列偏移角度下，复合微柱减小微柱阵列的临界分离尺寸；此种复合微柱阵列还有另一种效果，和连续横截面的微柱比，在同样的微柱尺寸下，可以用较大的阵列偏移角度取得相同的临界分离尺寸，较大的阵列偏移角度可产生更高的分离通量，分离更大体积的样品，提高分离效率。

附图说明

图1和图2为本发明侧向偏移微柱阵列芯片的结构示意图，其中，各标记如下：

1基片、2盖片、3微柱单元、4进样口、5目标颗粒收集出口、6废液出口。

图3为复合微柱结构1的横截面的示意图。

图4为复合微柱结构2的横截面的示意图。

图5为复合微柱结构3的横截面的示意图。

图6为复合微柱结构4的横截面的示意图。

图7为复合微柱结构5的横截面的示意图。

图8为流体经过图5所示复合微柱结构的流向示意图。

图9为含有不同尺寸颗粒的流体样品经过图5所示复合微柱结构时大中小颗粒的分离示意图。

图10为圆形、三角形和图5所示复合型微柱阵列的分离通量比较示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于下述实施例。

如图1或图2所示，本发明侧向偏移微柱阵列芯片，包括基片1和与基片1密封配合的盖片2，基片1和盖片2由玻璃、硅和聚合物中的一种或多种制成；聚合物可为聚甲基丙烯酸甲酯、双酚a型聚碳酸酯、2,2-双(4-羟基苯基)丙烷聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、环烯烃聚合物和环烯烃共聚物中的至少一种，制备所述环烯烃聚合物和环烯烃共聚物的环烯烃选自环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环丁二烯、环戊二烯和环己二烯的一种或多种。

基片1或盖片2上设有单边侧向偏移微柱阵列(图1)或双边侧向偏移微柱阵列(图2)。本发明侧向偏移微柱阵列芯片包含布置成列的侧向偏移微柱阵列，每个后续列的微柱单元相对于前一列按照一定角度偏移，微柱单元的尺寸为微米级或纳米级，横截面为一个或多个圆形、三角形、矩形或异形结构的每个微柱单元3由两个或两个以上独立的微柱组成，微柱之间的空隙形成一个或多个通道，以偏移的方向为上，一个或多个通道中，一个或多个通道中，至少有一个通道的开口方向与侧向偏移微柱阵列的偏移方向不同，具体可包括至少一个横截面为l型的通道，通道横截面的最小尺寸(宽度或高度)小于芯片的临界分离尺寸，直径小于通道横截面最小尺寸的颗粒能够通过该通道；芯片的一端设有用于通入流体样品和/或缓冲液的1个或多个进样口4，另一端设有用于收集直径大于临界分离尺寸的颗粒的目标颗粒出口5和用于回收直径小于临界分离尺寸的颗粒的废液口6。

具体地，如图3-图5所示，每个微柱单元可由两个独立的微柱组成，两个微柱的横截面可为圆形、三角形、矩形或异形结构，两个微柱之间的空隙形成一个横截面为l型的通道。

具体地，如图6所示，每个微柱单元可由三个独立的微柱组成，三个微柱的横截面可分别为l型、矩形、矩形，三个微柱之间的空隙形成两个横截面为l型的通道。两个横截面为l型的通道共用一个出口。

具体地，如图7所示，每个微柱单元可由四个独立的微柱组成，四个微柱的横截面可分别为l型、矩形、矩形、矩形，四个微柱之间的空隙形成三个横截面为l型的通道。三个横截面为l型的通道共用一个出口。

使用时，含有不同尺寸颗粒的流体样品和/或不含颗粒的缓冲液从1个或多个进样口通入芯片，如图8-图9所示，流体样品流经侧向偏移微柱阵列时，直径大于临界分离尺寸的颗粒路径如图9中实线所示，沿着侧向偏移微柱阵列的偏移角度运动；直径小于通道横截面最小尺寸(宽度或高度)的颗粒路径如虚线所示，一部分经过通道，一部分经过纵向流道，汇集于下方的横向流道，最终保持原流向移动；直径介于临界分离尺寸和通道横截面最小尺寸(宽度或高度)的颗粒经过纵向流道汇集于下方的横向流道，最终保持原流向移动；不同尺寸的颗粒产生空间分离，直径大于临界分离尺寸的颗粒从目标颗粒收集出口流出；直径小于临界分离尺寸的颗粒从废液出口流出。本发明微柱单元为复合微柱，能起到过滤小尺寸颗粒的作用，从而让大尺寸颗粒在进入下一行阵列前具有富集效果。

本发明芯片可用于分离液体样本中的微米或纳米颗粒，包括生物样品中的细胞、细菌、病毒等物质，包括但不限于如下任一：(1)分离外周血样品中的循环肿瘤细胞；(2)分离胸腔积液、腹水积液、淋巴液、尿液或骨髓样品中的肿瘤细胞；(3)分离外周血或脐带血样品中的有核红细胞；(4)分离外周血样品中的循环内皮细胞；(5)分离外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液、脑脊液或骨髓样品中的白细胞、t细胞、b细胞、淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞或造血干细胞；(6)分离外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液或骨髓样品中的红细胞或血小板；(7)分离外周血、胸腔积液、腹水积液、尿液、唾液、血浆、血清、脑脊液、精液、前列腺液或阴道分泌物样品中的细菌或病毒；(8)分离精液样品中的精子。

实施例1、

以具有图5所示结构的微柱单元的侧向偏移微柱阵列芯片为例，对本发明侧向偏移微柱阵列芯片的分离效果进行评价，该芯片基片为无机玻璃、盖片为聚二甲基硅氧烷。

一、具有同样阵列尺寸和偏移角度的不同微柱结构的临界分离尺寸

为了比较不同微柱结构对临界分离尺寸的影响，采用图1所示芯片的进口和出口设计，芯片中的微柱结构分别为圆形微柱、三角形微柱、图5所示的复合微柱。圆形微柱的直径10微米，行间距10微米，列间距10微米，阵列侧向偏移6度；三角形微柱底边长10微米，高10微米，行间距10微米，列间距10微米，阵列侧向偏移6度；复合微柱长度和宽度都为10微米，行间距10微米，列间距10微米，阵列侧向偏移6度；复合微柱内的小通道宽度2微米，复合微柱内小矩形微柱的长度和宽度都为4微米；上述芯片中的微柱高度都为10微米。

通过如下步骤得到上述具有同样阵列尺寸和偏移角度的三种不同微柱结构的临界分离尺寸：将pbs缓冲液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)和含有固定尺寸的聚苯乙烯微米颗粒的pbs缓冲液通过芯片的两个进口分别通入上述具有相同阵列尺寸和偏移角度的三种不同微柱结构的芯片中，其中，上面的进口通入pbs缓冲液，下面的进口通入含有固定尺寸的聚苯乙烯微米颗粒的pbs缓冲液，pbs缓冲液和含有固定尺寸的微米颗粒的pbs缓冲液的体积比为1:1-1:5，固定尺寸的微米颗粒的颗粒尺寸分别为2微米、3微米、4微米和5微米，流速控制在3-5毫米/秒，pbs缓冲液和含有固定尺寸的微米颗粒的pbs缓冲液共同流经侧向偏移微柱阵列，不同尺寸的微米颗粒分离开来，目标颗粒收集出口5和废液6分别用于收集颗粒富集液和废液，并用显微镜观察收集到的富集液和废液中颗粒的尺寸大小。对于一种微柱结构，如果高于某一尺寸的颗粒能够全部收集于目标颗粒收集出口5，并且小于这一尺寸的颗粒不能全部收集于废液出口6，则这一尺寸即为这种微柱结构的临界分离尺寸。统计三种微柱结构的临界分离尺寸，如表1所示，同样的阵列尺寸和侧向偏移角度条件下，复合微柱阵列具有最小的临界分离尺寸，本发明的复合微柱能显著减小临界分离尺寸。

表1、复合微柱阵列和圆形微柱阵列以及三角形微柱阵列的临界分离尺寸比较

二、具有同样阵列尺寸和临界分离尺寸的不同微柱结构的偏移角度

为了比较不同微柱阵列侧向偏移角度对尺寸分离的影响，采用芯片1所示的进口和出口设计，芯片1中的微柱结构分别为圆形微柱、三角形微柱、图5所示的复合微柱。圆形微柱的直径10微米，行间距10微米，列间距10微米，微柱阵列的侧向偏移角度分别为3度、3.5度、4度、4.5度、5度、5.5度、6度、6.5度、7度、7.5度、8度、8.5度、9度、9.5度和10度；三角形微柱底边长10微米，高10微米，行间距10微米，列间距10微米，微柱阵列的侧向偏移角度分别为3度、3.5度、4度、4.5度、5度、5.5度、6度、6.5度、7度、7.5度、8度、8.5度、9度、9.5度和10度；复合微柱长度和宽度都为10微米，行间距10微米，列间距10微米；复合微柱内的小通道宽度2微米，复合微柱内小矩形微柱的长度和宽度都为4微米，微柱阵列的侧向偏移角度分别为3度、3.5度、4度、4.5度、5度、5.5度、6度、6.5度、7度、7.5度、8度、8.5度、9度、9.5度和10度；上述芯片中的微柱高度都为10微米。

通过如下步骤得到上述具有同样阵列尺寸和临界分离尺寸的三种不同微柱结构的侧向偏移角度：将pbs缓冲液和含有4微米直径颗粒的pbs缓冲液通过芯片的两个进口分别通入上述具有相同阵列尺寸和临界分离尺寸的三种不同微柱结构的芯片中，其中，两个进口中，上面的进口通入pbs缓冲液，下面的进口通入含有4微米直径颗粒的pbs缓冲液，pbs缓冲液和含有4微米直径颗粒的pbs缓冲液的体积比为1:1-1:5，流速控制在3-5毫米/秒，目标颗粒收集出口5和废液出口6分别用于收集颗粒富集液和废液，并用显微镜观察收集到的富集液和废液中颗粒的尺寸大小。对于一种微柱结构，如果阵列侧向偏移角度低于某一数值，4微米颗粒能够全部收集于废液出口6；如果高于这一数值，4微米颗粒不能全部收集于废液出口6，则这一阵列侧向偏移角度即为对应实现4微米临界分离尺寸。实验结果如表2所示，相同间隔的圆形微柱阵列、三角形微柱阵列和复合微柱阵列在取得相同临界分离尺寸(4微米)条件下，复合微柱阵列具有最大的阵列偏移角度。表明，和连续横截面的微柱比，在同样的微柱尺寸下，本发明复合微柱可以用较大的阵列偏移角度取得同样的临界分离尺寸。

表2、复合微柱阵列和圆形微柱阵列以及三角形微柱阵列的偏移角度比较

较大的阵列偏移角度可产生更高的分离通量，分离更大体积的样品。如图10所示，为了富集溶液中大于4微米的颗粒，圆形阵列的最大角度是4.5度，三角形阵列的最大角度是6度，复合微柱阵列的最大角度是9度，含有复合微柱阵列的芯片宽度最大，因而在同样的流速下本发明能产生更大的分离通量。