一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌的制作方法

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌。

背景技术：

二肽酶是一类作用于二肽肽键的外切水解酶类的统称，主要是作用于由肽键连接的两个氨基酸残基所组成的二肽化合物，属于外肽酶中羧肽酶的一种类型。

近年来利用二肽酶的逆向催化作用，可以合成一些有价值的二肽，并广泛的应用于饲料、食品及医药行业中。例如：在早期断奶仔猪日粮中添加适量谷氨酰胺二肽，以肽形式吸收gln，克服游离gln因热不稳定性及溶解度低等造成的吸收率差的缺点，可缓减仔猪断奶的应激，提高断奶仔猪生长性能和免疫能力，降低腹泻率。利用天冬氨酸二肽酶可制备甜味剂，与化学合成相比，不仅不污染环境，还大大提高了合成效率。丙谷二肽属于氨基酸类的化学药剂，其作为氨基酸类肠外营养剂，对处于生命危急时刻的病人起着重要作用，有资料显示，及时补充丙谷二肽，可以显著缩短病人住院治疗和恢复的时间，药用价值的特殊性，就像生理盐水、葡萄糖一样，将成为救护病人的必需品，具有医疗和经济的双重意义。

技术实现要素：

本发明从桦褐孔菌(inonotusobliquus)菌株中克隆到去跨膜区的二肽酶基因idp，其核苷酸序列如seqidno.1所示，该基因全长为1326bp，分析表明，gc含量为49％，编码442个氨基酸组成的蛋白。由该基因编码的桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。该蛋白大小48kda，等电点预测为6.25。

将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明idp的基因工程菌。

根据tmhmm2.0预测dp氨基酸序列的跨膜区显示，在55-77位氨基酸左右具有一个跨膜区结构，如图1所示。通过bamhi和noti双酶切巴斯德毕赤酵母表达载体ppiczαa，并通过pcr分别扩增去跨膜区后的两个片段idp1和idp2，大小分别为162bp和1164bp。将idp1和idp2融合后插入到双酶切后的ppiczαa上构建得到含idp的表达载体idp-ppiczαa。进一步将该表达载体转到巴斯德毕赤酵母x-33中并筛选获得含idp基因的能够表达idp的基因工程菌idp-x33。实验表明由该基因编码的二肽酶最适反应温度为50℃，最适反应ph值为7.2，将该去跨膜区的桦褐孔菌二肽酶命名为idp。

本发明还提供一种制备上述idp的方法，其是通过培养idp-x33，经甲醇诱导表达获得桦褐孔菌去跨膜区的二肽酶idp。所述培养条件为28℃，初始ph为7，200rpm培养96小时。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％。

本发明的有益效果：本发明的胞外分泌表达表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌可胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶，为工业化生产桦褐孔菌二肽酶奠定了基础；本发明的制备二肽酶的方法，胞外酶活可达24u/ml，细胞密度(od600)为24.5，胞外分泌效率可达1u/od600。

附图说明

图1tmhmm分析dp氨基酸序列跨膜区；

图2载体酶切和目的基因pcr电泳回收图，其中a：ppiczαa的双酶切电泳图，泳道m为dna标准分子量(kb)；泳道2：ppiczαa的双酶切；b：dp分段pcr电泳图，泳道1：dp1的pcr电泳图；泳道2：dp2的pcr电泳图；

图3idp-ppiczαa重组质粒示意图；

图4zeocin筛选毕赤酵母转化子；

图5重组蛋白sds-page检测，其中，泳道m：蛋白marker；泳道2：胞外分泌的idp蛋白；

图6idp的最适温度和最适ph；其中，a：最适温度；b：最适ph。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、连接、回收、转化、pcr扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(invitrogen)生物公司完成。

实施例1桦褐孔菌cdna的制备

1.1桦褐孔菌总rna的提取

(1)取适量的桦褐孔菌菌丝，滤纸吸干水分，液氮研磨，加入1mltrizol试剂(invitrogen)，振荡器振荡5min，室温静置1min；

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；

(3)4℃，12000rpm，15min；

(4)吸取上清，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min；

(5)4℃，12000rpm，15min；

(6)倒掉上清，用1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm，4℃，5min；

(7)重复(6)步骤一次；

(8)倒掉上清，干燥10min；

(9)加入适量的depc水溶解，得到总rna；

1.2桦褐孔菌cdna第一链的制备

反转录采用由promega公司生产的反转录酶(mmlv)具体操作如下：

25μl反应体系将以下成分加到一个无核酸酶的离心管中：

42℃温浴60min；

95℃加热5min终止反应，冷冻保存。

实施例2去跨膜区的桦褐孔菌二肽酶基因的克隆

2.1引物设计

根据桦褐孔菌中dp基因的序列以及tmhmm软件预测跨膜区的位置设计合成了以下两对引物：

p1-f：5’-ggatccatgtcctatccaagacaatctgcggag-3’(seqidno.3)

p1-r：5’-agtcagtccaaccactctcacgcgcggtatgtttgcg-3’(seqidno.4)

p2-f：5’-gagagtggttggactgactcgg-3’(seqidno.5)

p2-r：5’-gcggccgcctaagggtggggaatgtcggtg-3’(seqidno.6)

p1-f、p2-r中斜体并有下划线的部分是两端分别设计的bamhi和noti酶切位点；p1-r的下划线部分为同源序列。

2.2融合pcr法获得去跨膜区的桦褐孔菌二肽酶

2.2.1pcr法获得去跨膜区的桦褐孔菌二肽酶的两段

采用p1、p2引物，以桦褐孔菌cdna为模板，pcr反应体系为获得大小分别为162bp和1164bp的片段：

反应条件为：95℃5min，5℃40s，60℃40s，72℃1min，循环30次，72℃10min，4℃2min。

2.2.2pcr反应产物中回收目的片段

从pcr产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，pcr反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因dna，如图2b所示，目的基因长度分别为162bp和1164bp。按照dna回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为dp209-02)的方法进行回收。

2.2.3融合pcr将上述两段融合

以片段1和片段2为模板，q5酶为dna聚合酶，进行二轮pcr反应体系及反应条件如下：

反应条件：

以上述pcr产物为模板扩增idp

设计巢式引物如下，三轮pcr获得idp片段。

nestidp-f:5’-ggatccatgtcctatccaaga-3’(seqidno.7)

nestidp-r:5’-gcggccgcctaagggtgggg-3’(seqidno.8)

反应体系及反应条件如下：

反应条件：

2.3idp基因连接到巴斯德毕赤酵母表达载体ppiczαa。

2.3.1idp-ppiczαa表达质粒构建

如图2所示，用限制性内切酶bamhi和noti分别对idp和ppiczαa进行双酶切。回收载体和片段，用t4连接酶将其连接，将连接产物转化大肠杆菌dh5α(购自上海生工生物工程有限公司)。得到单拷贝表达质粒idp-ppiczαa如图3所示，送invitrogn公司测序。

实施例3idp-ppiczαa载体电转化到巴斯德毕赤酵母x-33中的分泌表达

3.1巴斯德毕赤酵母x-33(invitrogen公司购买)电转化感受态细胞的制备及其电击转化

(1)挑取新鲜的单菌落于5mlypd液体培养基中，于30℃，250rpm培养12-14小时；

(2)以0.1％的接种量接种到含500mlypd培养基的2l三角瓶中，于30℃，250rpm培养12-14小时，使其od600＝1.3-1.5；

(3)在4℃下1500rpm离心5分钟，收集细胞；

(4)用500-250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞两次；

(5)用20ml冰预冷的1m山梨醇溶液洗涤细胞一次；

(6)用1ml冰预冷的1m山梨醇溶液重悬细胞，至终体积为1.5ml左右，以80μl分装于小离心管；

3.2巴斯德毕赤酵母酵母细胞的电击转化

(1)将准备好的约100μg/μl的线性化idp-ppiczαa表达质粒约10μl，与80μl酵母感受态细胞混匀，在冰上放置约5分钟；

(2)把混合了dna的感受态细胞转入冰预冷的0.2cm的电转杯；

在1.5千伏的电压下转化；

(3)然后马上加入1ml冰预冷的1m山梨醇溶液于经转化的细胞中，把细胞混匀，转入1.5ml小离心管，30℃静止1-2h。

(4)取50-200ul涂布于含有100ug/mlypds平板(yeastextract1％，peptone2％，dextrose2％，sorbitol1m，agar2％，)，于30℃培养2至3天后观察，结果如图4所示。

3.3.idp-x33的重组菌株的筛选

3.3.1酵母菌落pcr法鉴定正确整合的转化子

在平板上选到阳性菌落，以5’aox1、3’aox1为引物，利用酵母菌落pcr的方法进一步验证得到正确整合的转化子。

引物序列为：5’aox1：5′-gactggttccaattgacaagc-3′(seqidno.9)

3’aox1：5′-gcaaatggcattctgacatcc-3′(seqidno.10)

模板的处理方法：

(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的d2-buffer(1l：异硫氰酸胍472.64g，1mol/lph8.0tris·hcl缓冲液50ml，β-巯基乙醇7ml)中混匀；

(2)将混合液于100℃沸水浴5min；

(3)12000rpm，离心30s，弃上清；

(4)用无菌水洗涤沉淀2次；

(5)将沉淀溶于20μl的ddh2o，95℃作用5min；

(6)离心后得到上清液即为模板。

pcr反应体系：

反应条件：95℃5min；95℃40s，60℃40s，72℃1min30s，30cycles；72℃10min。

3.4idp-x33摇瓶发酵

挑取idp-x33，接种于25mlbmgy培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)，于28℃，200rpm摇床培养至od600为4.0-8.0左右，转接到装有50mlbmmy培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1.0％甲醇，100mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为1.0％，诱导表达4天。测量其细胞密度(od600)、sds-page检测胞外目的蛋白及idp的酶活。

3.5sds-page检测目的蛋白表达情况

12％分离胶的配方见表1，5％浓缩胶的配方见表2：

表112％分离胶的配方

表25％浓缩胶的配方

将待测样品与2×sds上样缓冲液等体积混合，沸水浴煮沸10min，取适量上样。装好电泳装置，接通电源，调节电压，浓缩胶为8v/cm，分离胶电压15v/cm，电泳约1h，直至溴酚兰染料到达分离胶底部，停止电泳。从玻璃板上拆下凝胶，移入盛有考马斯亮蓝染色液的容器内，放到水平摇床上轻轻振荡染色，1h后，弃染液，将凝胶在水中漂洗两次，加入脱色液脱色，直到蛋白条带清晰可见，尽量去除背景色，期间更换脱色液两到三次。最后扫描凝胶，保存图像，结果如图5所示。

3.6.idp酶活测定

3.6.1gly标准曲线的绘制

(1)先配置2.5mmol/l的gly母液于试管中，依次稀释成浓度为0mmol/l，0.2mmol/l，0.4mmol/l，0.6mmol/l，0.8mmol/l，1.0mmol/l的标准溶液，用水补足至1ml，各加入1mlph7.0，2mol/l磷酸钾缓冲液；接着添加1ml镉-茚三酮显色液，用漩涡振荡器混匀，在84℃水浴中加热5min，放置于冰上冷却。5min后，加入3ml水稀释，漩涡振荡，测定od507处的吸光值。(不同的氨基酸其显色的颜色是不一致的，不同颜色应测定不同吸光度下的吸光值)。以od507为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

3.6.2样品的测定

(1)底物gly-gly溶于0.1mol/l，ph7.0的磷酸钾缓冲液中至终浓度为2.0mmol/l。

(2)取1.8ml底物溶液与0.2ml纯化蛋白于5ml离心管中，将其置于37℃保温6h。

(3)取50ml反应液与蒸馏水稀释至1ml。

(4)将上述溶液与2ml茚三酮显色液或镉-茚三酮发生反应，反应条件为84℃，水浴5min，放置于冰上冷却并测定od507。

3.6.3酶活定义为：37℃，1分钟内1ml酶液使底物分解生成的氨基酸的微摩尔数，单位为mol·h^-1ml^-1，根据测得的吸光度，以及标准曲线的方程式得到生成的氨基酸的浓度a，则，

酶活力＝a×n×v/(3×0.2×min)

式中：a-氨基酸浓度的差值

n-稀释倍数

v-酶-底物反应总体积，ml

0.2-参与反应酶液体积

3-显色反应溶液体积

h-反应时间

3.7.idp的最适温度和最适ph测定

将反应体系分别置于不同的温度下进行水浴反应，酶活测定方法同3.4。将反应体系的缓冲液调成不同的ph进行反应，酶活测定方法同3.4。检测结果如图6所示，由该基因编码的二肽酶最适反应温度为50℃，最适反应ph值为7.2。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1326

<212>dna

<213>桦褐孔菌二肽酶(inonotusobliquus)

<400>1

atgtcctatccaagacaatctgcggagaacgcgcctttacttggtgttccaactcagcca60

gctccctatccaggtcccttgtctccttctctgtacaatgaccccaacacttcccggaaa120

cctctagacgagagagaagctcagcgcaaacataccgcgcgtgagagtggttggactgac180

tcggatccgcgagcagttgcttcagcagtcctatctcgttcacccattattgacggccat240

attgacctgccggagctggcccgcgtcgtgtacggaaataacatttccgcgtttgacctt300

cacaagcctatgcctggccatgttgatattccacgcctacgtgaaggacgagtgggaggt360

ttcttctggtccgtttacgtcgactgcaagccagagaacgagaacttcactaagccttca420

tatcgcgtgcgggataccctcgagcaaatcgacgtagcacaccttctcattgatgcatac480

ccagacacgtttcgacttgcaacctcttcaagtgacgtacgctcggcgatccgttcaaaa540

aagatcgcaagtcttattggagttgaaggtgcacaccagctcgggaactctctcgcggtc600

ttgcgacagtattacgcgctcggtgctcggtatctaacgcttacacactcctgtaataat660

gccttcgccgattcagctggcatcctatcctctccaccgccagtacacggtggacttagt720

acacttggaaaatcacttgtttatgagctcaatcgcctcgggatgtttgttgatttgtcg780

catgttagtgacgacactgcgaaacaggccctggcgctttctgcagctagaggcgctccc840

gttatttggagccattcatctgcgagggcggtgcataatgtaccgagaaacgttccagat900

aacatattggaactacttacgactgaagatgatgcaatggctcgttggcgaggacaaact960

gacggtgtcgtgatggtcaacttcgcgccaatctttgtcgcttctgagggtaaagcaacc1020

ctggagaaagtcgcagaccatgtagaccatatcgccaaagttgcgggcaaagaacatgtc1080

ggtattggcagtgacttcgatggtatcgactctgtccctactggactcgaggacgtatcc1140

aaatatccagaccttatcgcagagttgtacgcacgtgggtggtcccgccgagagctggct1200

ggacttgccggtggaaatctcctgcgcgtcatggaacgagcagagcgcgttgctcatcag1260

atgcagaaagacggggctaaaccatccatggatatttatgataaacgcaccgacattccc1320

caccct1326

<210>2

<211>442

<212>prt

<213>桦褐孔菌二肽酶(inonotusobliquus)

<400>2

metsertyrproargglnseralagluasnalaproleuleuglyval

151015

prothrglnproalaprotyrproglyproleuserproserleutyr

202530

asnaspproasnthrserarglysproleuaspgluargglualagln

354045

arglyshisthralaarggluserglytrpthraspseraspproarg

505560

alavalalaseralavalleuserargserproileileaspglyhis

65707580

ileaspleuprogluleualaargvalvaltyrglyasnasnileser

859095

alapheaspleuhislysprometproglyhisvalaspileproarg

100105110

leuarggluglyargvalglyglyphephetrpservaltyrvalasp

115120125

cyslysprogluasngluasnphethrlysprosertyrargvalarg

130135140

aspthrleugluglnileaspvalalahisleuleuileaspalatyr

145150155160

proaspthrpheargleualathrserserseraspvalargserala

165170175

ileargserlyslysilealaserleuileglyvalgluglyalahis

180185190

glnleuglyasnserleualavalleuargglntyrtyralaleugly

195200205

alaargtyrleuthrleuthrhissercysasnasnalaphealaasp

210215220

seralaglyileleuserserproproprovalhisglyglyleuser

225230235240

thrleuglylysserleuvaltyrgluleuasnargleuglymetphe

245250255

valaspleuserhisvalseraspaspthralalysglnalaleuala

260265270

leuseralaalaargglyalaprovaliletrpserhisserserala

275280285

argalavalhisasnvalproargasnvalproaspasnileleuglu

290295300

leuleuthrthrgluaspaspalametalaargtrpargglyglnthr

305310315320

aspglyvalvalmetvalasnphealaproilephevalalaserglu

325330335

glylysalathrleuglulysvalalaasphisvalasphisileala

340345350

lysvalalaglylysgluhisvalglyileglyserasppheaspgly

355360365

ileaspservalprothrglyleugluaspvalserlystyrproasp

370375380

leuilealagluleutyralaargglytrpserargarggluleuala

385390395400

glyleualaglyglyasnleuleuargvalmetgluargalagluarg

405410415

valalahisglnmetglnlysaspglyalalysprosermetaspile

420425430

tyrasplysargthraspileprohispro

435440

<210>3

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggatccatgtcctatccaagacaatctgcggag33

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agtcagtccaaccactctcacgcgcggtatgtttgcg37

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gagagtggttggactgactcgg22

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gcggccgcctaagggtggggaatgtcggtg30

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggatccatgtcctatccaaga21

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gcggccgcctaagggtgggg20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gactggttccaattgacaagc21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gcaaatggcattctgacatcc21