水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及水样中感染性疾病的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落pcr检测方法在水样中志贺氏菌（shigellaspp）、小肠结肠炎耶尔森菌（yersiniaenterocolitica）与副溶血性弧菌（vibrioparahemolyticus）检测中的应用。

背景技术

志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌及副溶血性弧菌是引起水源性疾病的主要病原菌。水在人类日常生活中必不可少，水中的致病菌不仅可引起人类腹痛、呕吐、腹泻等胃肠道症状，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，甚至可引起败血症，造成死亡。不仅造成了巨大的经济损失和严重的环境污染，更重要的是危及人们的健康甚至生命。当前志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌及副溶血性弧菌的常规检测方法基于培养法，操作耗时且灵敏度低。

liu,b.等（liu,b.,etal.,developmentofarealtimepcrassayforrapiddetectionofvibrioparahaemolyticusfromseafood.proteincell,2012.3(3):p.204-12.）发现vp1332基因可作为检测副溶血性弧菌的特异性标志物。zheng,h.等（zheng,h.,etal.,investigationofvirulencegenesinclinicalisolatesofyersiniaenterocolitica.femsimmunolmedmicrobiol,2008.53(3):p.368-74.）调查了小肠结肠炎耶尔森菌株中特异性毒力基因的分布率，发现inv基因占100%。vu,d.t.等（vu,d.t.,etal.,detectionofshigellabyapcrassaytargetingtheipahgenesuggestsincreasedprevalenceofshigellosisinnhatrang,vietnam.jclinmicrobiol,2004.42(5):p.2031-5.）发现ipah基因可作为检测志贺氏菌的特异性毒力基因。korbie,d.j.等（korbie,d.j.andj.s.mattick,touchdownpcrforincreasedspecificityandsensitivityinpcramplification.nat.protocols,2008.3(9):p.1452-1456.）发现降落pcr可提高pcr的特异性与灵敏度。当前尚无可同时检测志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌的多重降落pcr的报道。本发明建立的多重降落pcr可同时直接检测水中的副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌与志贺氏菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌感染的快速诊断与流行病学调查。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可同时快速检测水样中志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的：

（一）滤膜浓集致病菌后，提取致病菌dna

（二）多重降落pcr法扩增检测待检样本dna中的vp1332、inv基因与ipah序列，具体步骤如下：

反应体系：25µl

h2o7.65µl

缓冲液（10×pcr）2.5µl

bsa（10mg/ml）0.25µl

vp_vp1332-f（10µmol/l）0.2µl

vp_vp1332-r（10µmol/l）0.2µl

ye_inv-f（10µmol/l）3µl

ye_inv-r（10µmol/l）3µl

sh_ipah-f（10µmol/l）0.2µl

sh_ipah-r（10µmol/l）0.2µl

mgcl2（25mm）2.5µl

dntp（2.5mm）3µl

taqdna聚合酶（5u/µl）0.3µl

dna模板2µl

引物：

志贺氏菌引物为：

sh_ipah-f：5’-cgccatatcagagtcatcact-3’

sh_ipah-r：5’-tgcgtgcagagacggtat-3’

小肠结肠炎耶尔森菌引物为:

ye_inv-f：5’-accacggcaatagttctaatc-3’

ye_inv-r：5’-cggcaacaatatcagatggaga-3’

副溶血性弧菌引物为：

vp_vp1332-f：5’-tacgctgaagataaactaacgg-3’

vp_vp1332-r：5’-tgcggaagaagacttacgag-3’

pcr反应循环参数如下：

94℃5min；94℃30s,61℃（每循环降低0.5℃）30s,72℃1min，20个循环；94℃30s,51℃30s,72℃1min,20个循环；72℃7min。

（三）电泳检测鉴定：

对多重降落pcr反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有870bp、393bp、193bp条带则分别代表检出副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌。

有益效果：本发明所建立的多重降落pcr可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌，对三者dna的检测下限分别达0.005ng、0.5ng与0.005ng。该多重降落pcr可广泛用于志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌感染的快速诊断与流行病学调查。

附图说明

图1为本发明实施例1建立的多重降落pcr的特异性检测结果图。

附图为建立的多重降落pcr的特异性检测结果；m：dl2000dna分子质量标准；泳道1-14模板依次对应为：金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、卡它莫拉菌（moraxella（branhamella）catarrhalis）、肺炎链球菌（streptococcuspneumoniae）、肺炎克雷伯菌（klebsiellapneumoniae）、鲍曼不动杆菌（acinetobacterbaumannii）、粪肠球菌（enterococcusfaecalis）、流感嗜血杆菌（haemophilusinfluenza）、耻垢分枝杆菌（mycobacteriumsmegmatis）、牛分枝杆菌、大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）、结核分枝杆菌、卡介苗、甲型副伤寒杆菌（salmonellaparatyphia）。泳道15模板为副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌。泳道16为阴性对照。

具体实施方式

实施例1：

将水样滤膜浓集细菌后，取出滤膜放于1.5mleppendorf管,再向eppendorf管中加入500ul双蒸水,使滤膜完全进入水中。将eppendorf管置于沸水中煮沸15分钟，12000rpm离心10分钟后，取上清，即为提取的致病菌dna。提取的dna直接用于pcr扩增或置于-20℃保存备用。

pcr扩增总体系25µl，在200µlpcr小管内依次加入7.65µl双蒸水，2.5µl缓冲液（10×pcr），bsa（10mg/ml）0.25µl、引物vp_vp1332-f（10µmol/l）0.2µl，vp_vp1332-r（10µmol/l）0.2µl，ye_inv-f（10µmol/l）3µl，ye_inv-r（10µmol/l）3µl，sh_ipah-f（10µmol/l）0.2µl，sh_ipah-r（10µmol/l）0.2µl，mgcl2（25mm）2.5µl，dntp（2.5mm）3µl，taqdna聚合酶（5u/µl）0.3µl，2µl提取的水样致病菌dna。同时设志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌阳性模板对照与阴性对照（双蒸水作为模板）。手指轻弹混匀，短暂离心后放入pcr仪。

引物序列如下：

志贺氏菌引物为：

sh_ipah-f：5’-cgccatatcagagtcatcact-3’

sh_ipah-r：5’-tgcgtgcagagacggtat-3’

小肠结肠炎耶尔森菌引物为:

ye_inv-f：5’-accacggcaatagttctaatc-3’

ye_inv-r：5’-cggcaacaatatcagatggaga-3’

副溶血性弧菌引物为：

vp_vp1332-f：5’-tacgctgaagataaactaacgg-3’

vp_vp1332-r：5’-tgcggaagaagacttacgag-3’

设置pcr反应循环参数：94℃5min；94℃30s,61℃（每循环降低0.5℃）30s,72℃1min，20个循环；94℃30s,51℃30s,72℃1min,20个循环；72℃7min。

扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5µl与6×上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于1×tae溶液中，在100v电压下，电泳30min，电泳后经1µg/µl的溴化乙锭浸泡染色10-20min后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。如阴性对照无条带，阳性对照出现对应大小的条带，对多重降落pcr反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有870bp、393bp、193bp条带则分别代表检出副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌。如阳性对照无对应条带出现或阴性对照出现非特异性条带，则判为实验失败，需重新检测。