一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用与流程

本发明属于高通量测序
技术领域：
，具体涉及一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用。
背景技术：
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。常规化疗或放疗会严重影响患者的生活质量和身体素质，所以靶向治疗越来越受到重视。针对非小细胞肺癌，已有的科学研究和临床实验已经找出了一系列靶向治疗位点和药物。靶向治疗与传统的化疗法不同，不干扰所有持续分裂细胞，而是通过药物干扰癌变或肿瘤增生所需的特定分子，从而特异的阻止癌细胞增长。药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。与传统的放化疗相比，靶向治疗不仅可以减少毒副反应，而且可以显著提高治疗的有效性，显著延长病人的生存期并提高生存质量。通过基因检测，明确肺癌细胞的分子分型，找到可能的靶药位点或耐药位点，可为患者提供更精准的用药指导。目前，高通量测序技术已广泛应用到医学研究和临床诊断领域，为致癌位点的检测提供了新的检测手段。高通量测序技术因其结果覆盖范围的全面性，以及不断下降的测序成本，在医学研究和临床应用中表现出越来越高的性价比。有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法，缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率成为高通量测序技术拓展应用领域的一大关键点。经典的高通量文库构建步骤包括：1.基因组打断(包括物理打断法和化学打断法，如covaris超声打断、fragmentase酶切打断)；2.双链dna(deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)末端修复；3.3’末端加datp(deoxyadenosinetriphosphate，三磷酸脱氧腺苷)；4.加与测序平台匹配的接头；5.pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)扩增。每个步骤间都需要进行纯化反应，有时还需要在酶反应之后进行一次片段选择(步骤1、4、5其中之一)，整个流程需要大概8～9个小时才能完成。经典的高通量文库构建方法是目前接受度最广、数据表现最稳定、数据偏向性最少的建库方法，但其建库过程耗时较长，步骤过多且纯化过程中目的片段的损失，使得文库的模板的利用率不高，且可能造成交叉污染。经典的高通量文库构建方法日益无法满足快速发展的市场对低起始量微量建库和快速报告周期的需求。技术实现要素：鉴于上述技术问题，本发明提供了一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用。利用本发明提供的方法构建肺癌高通量测序文库，用时短，且不易引发交叉污染。本发明提供了一种肺癌高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)以肺癌相关片段为模板进行多重pcr扩增，得到肺癌初始文库；(2)向装有所述步骤(1)肺癌初始文库的原管中加入0.3～0.7倍pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，取上清液至新管，弃磁珠；(3)向所述步骤(2)含有上清液的新管中加入0.7～1.1倍pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；(4)对所述步骤(3)磁珠进行清洗纯化，得到纯化的肺癌初始文库；(5)对所述步骤(4)纯化的肺癌初始文库进行第二次pcr扩增，得到肺癌测序文库；(6)向装有所述步骤(5)肺癌测序文库的原管中加入0.8～1.2倍第二次pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；(7)对所述步骤(6)磁珠进行清洗纯化；(8)洗脱磁珠表面的dna，得到的洗脱液即为纯化的肺癌测序文库；所述步骤(3)～(8)在同一个管中操作。优选的，所述步骤(1)中pcr扩增包括两阶段，第一阶段为rna扩增，所述rna扩增用引物的核苷酸序列如seqidno.1～50所示；第二阶段为dna扩增，所述dna扩增用引物的核苷酸序列如seqidno.51～70所示。优选的，在所述步骤(1)中pcr采用30μl的pcr反应体系，所述pcr反应体系包括以下含量的组分：10μl的反应缓冲液，8μl浓度独立为0.9～1.1μmol/l的rna扩增用引物，1μl浓度为10ng/μl的模板和11μl的ddh2o；所述扩增反应液包括200u/l聚合酶，100mmol/lph8.8的tris-hcl，500mmol/l的kcl，15mmol/l的mgcl2和质量浓度为0.8％的np-40。优选的，所述步骤(1)中的pcr扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s，60℃，4min，18个循环；72℃，4min。优选的，所述步骤(4)中的清洗用溶剂包括b&w和/或体积比68～72％的乙醇水溶液。优选的，所述步骤(5)第二次pcr扩增中包括上游街头引物和下游街头引物，所述上游街头引物的核苷酸序列如seqidno.71所示；所述下游街头引物的核苷酸序列如seqidno.72～167所示。优选的，在所述步骤(5)第二次pcr采用30μl的pcr反应体系，所述pcr反应体系包括10μl反应缓冲液，1μl浓度独立为10μmol/l的dna扩增用上游街头引物，1μl浓度独立为10μmol/l的dna扩增用下游街头引物和余量的水；所述反应缓冲液包括200u/l聚合酶，100mmol/lph8.8的tris-hcl，500mmol/l的kcl，15mmol/l的mgcl2和质量浓度为0.8％的np-40。优选的，所述步骤(5)中第二次pcr扩增的反应程序为：95℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s，6～8个循环；72℃，5min。本发明提供了上述构建方法得到的肺癌高通量测序文库。本发明还提供了上述肺癌高通量测序文库在体外定性检测非小细胞肺癌(nsclc)患者的石蜡包埋组织切片中egfr、braf、pik3ca、kras、nras、alk、ros1基因的变异中的应用。有益效果：本发明提供了一种肺癌高通量测序文库的构建方法，该方法全程只更换一次容器，其他操作都在同一容器中进行，减少目的片段的损失，同时避免了交叉污染的可能性。本发明提供的方法利用磁珠反应结合洗涤操作，最大程度保证了纯化的高效和便捷。利用本发明提供的方法，能使模板的利用率大大提高。由于本发明提供的肺癌高通量文库构建方法操作简单，容器更换少，结合磁珠纯化的方法，可实现肺癌高通量文库的自动化构建。附图说明图1-a为本发明实施例1中步骤一所述pcr产物(初始文库)的安捷伦2100生物分析仪的质控图；图1-b为本发明实施例1中步骤四所述第二轮pcr纯化后产物(纯化后的测序文库)的安捷伦2100生物分析仪的质控图；图2为本发明实施例2所述自动化构建肺癌高通量测序文库示意图，其中，a、b、c、d、e、f、g、h为充满不同试剂的管道，其中a为一轮pcr的反应液，b为磁珠溶液，c为bw13洗液，d为70％的乙醇溶液，e为第二轮pcr的反应液，f为bw10洗液，g为空气，h为洗脱液；h和i分别为注入探头和吸取探头的阀门，j为电磁铁或强力磁铁。具体实施方式本发明提供了一种肺癌高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：(1)以肺癌相关片段为模板进行多重pcr扩增，得到肺癌初始文库；(2)向装有所述步骤(1)肺癌初始文库的原管中加入0.3～0.7倍pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，取上清液至新管，弃磁珠；(3)向所述步骤(2)含有上清液的新管中加入0.7～1.1倍pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；(4)对所述步骤(3)磁珠进行清洗纯化，得到纯化的肺癌初始文库；(5)对所述步骤(4)纯化的肺癌初始文库进行第二次pcr扩增，得到肺癌测序文库；(6)向装有所述步骤(5)肺癌测序文库的原管中加入0.8～1.2倍第二次pcr反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；(7)对所述步骤(6)磁珠进行清洗纯化；(8)洗脱磁珠表面的dna，得到的洗脱液即为纯化的肺癌测序文库；所述步骤(3)～(8)在同一个管中操作。本发明提供的肺癌高通量文库构建方法全程只需更换一次容器，其他操作都在同一容器中进行，能减少目的片段的损失，同时避免交叉污染的可能性。本发明以肺癌相关片段为模板进行多重pcr扩增，得到肺癌初始文库。在本发明中，所述肺癌相关片段优选包括kras、egfr、pik3ca、braf、nrasalk、ros1，本发明对肺癌相关片段的获得方法不作特别限定，本领域常规制备基因片段的方法均可。在本发明的实施例中，所述基因片段的获取方法为：查阅美国国立综合癌症网络(nationalcomprehensivecancernetwork)每年发布的各种恶性肿瘤临床实践指南，结合癌症体细胞突变目录(thecatalogueofsomaticmutationsincancer,cosmic),最终获取上述基因片段。在本发明中，所述pcr扩增优选包括两阶段，第一阶段为rna扩增，所述rna扩增的引物核苷酸序列优选包括rh_01_f(seqidno.1)、rh_01_r(seqidno.2)、rh_02_f(seqidno.3)、rh_02_r(seqidno.4)、rh_03_f(seqidno.5)、rh_03_r(seqidno.6)、rh_04_f(seqidno.7)、rh_04_r(seqidno.8)、rh_05_f(seqidno.9)、rh_05_r(seqidno.10)、rh_06_f(seqidno.11)、rh_06_r(seqidno.12)、rh_07_f(seqidno.13)、rh_07_r(seqidno.14)、rh_08_f(seqidno.15)、rh_08_r(seqidno.16)、rh_09_f(seqidno.17)、rh_09_r(seqidno.18)、rh_10_f(seqidno.19)、rh_10_r(seqidno.20)、rh_11_f(seqidno.21)、rh_11_r(seqidno.22)、rh_12_f(seqidno.23)、rh_12_r(seqidno.24)、rh_13_f(seqidno.25)、rh_13_r(seqidno.26)、rh_14_f(seqidno.27)、rh_14_r(seqidno.28)、rh_15_f(seqidno.29)、rh_15_r(seqidno.30)、rh_16_f(seqidno.31)、rh_16_r(seqidno.32)、rh_17_f(seqidno.33)、rh_17_r(seqidno.34)、rh_18_f(seqidno.35)、rh_18_r(seqidno.36)、rh_19_f(seqidno.37)、rh_19_r(seqidno.38)、rh_20_f(seqidno.39)、rh_20_r(seqidno.40)、rh_21_f(seqidno.41)、rh_21_r(seqidno.42)、rh_22_f(seqidno.43)、rh_22_r(seqidno.44)、rh_23_f(seqidno.45)、rh_23_r(seqidno.46)、rh_24_f(seqidno.47)、rh_24_r(seqidno.48)、rh_25_f(seqidno.49)、rh_25_r(seqidno.50)；第二阶段为dna扩增，所述dna扩增的引物核苷酸序列优选包括d_01_f(seqidno.51)、d_01_r(seqidno.52)、d_02_f(seqidno.53)、d_02_r(seqidno.54)、d_03_f(seqidno.55)、d_03_r(seqidno.56)、d_04_f(seqidno.57)、d_04_r(seqidno.58)、d_05_f(seqidno.59)、d_05_r(seqidno.60)、d_06_f(seqidno.61)、d_06_r(seqidno.62)、d_07_f(seqidno.63)、d_07_r(seqidno.64)、d_08_f(seqidno.65)、d_08_r(seqidno.66)、d_09_f(seqidno.67)、d_09_r(seqidno.68)、d_10_f(seqidno.69)、d_10_r(seqidno.70)。本发明先进行逆转录，得到cdna，再以得到的cdna为模板，进行dna扩增。dna扩增产物即为肺癌初始文库。在本发明中，所述多重pcr扩增优选在0.2ml的pcr管中进行。本发明优选采用30μl的pcr反应体系，所述pcr反应体系优选包括以下含量的组分：10μl的反应缓冲液，8μl浓度独立为0.9～1.1μmol/l的rna扩增用引物，1μl浓度为10ng/μl的模板和11μl的ddh2o；所述扩增反应液包括200u/l聚合酶，100mmol/lph8.8的tris-hcl，500mmol/l的kcl，15mmol/l的mgcl2和质量浓度为0.8％的np-40。在本发明中，所述pcr扩增程序优选为：95℃，3min；95℃，30s，60℃，4min，18个循环；72℃，4min。得到肺癌初始文库后，本发明向装有肺癌初始文库的原管中加入磁珠液进行反应。本发明对所述磁珠液的来源没有特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述磁珠液选自agencourtampurexpreagent试剂盒中的磁珠液。在本发明中，所述磁珠液反应前优选混匀，所述混匀的方式优选为吹吸。在本发明的实施例中，使用200μl移液枪调节至液体总体积的70～80％取量处，反复上下吹吸6～10次，所述吹吸的过程应避免气泡产生。在本步骤中，所述磁珠液的添加体积为0.3～0.7倍pcr反应体系体积，优选为0.4～0.6倍pcr反应体系体积，更优选为0.5倍pcr反应体系体积。在本发明中，所述反应的时间为1～30min，优选为1.5～5min，更优选为2min。反应结束后，本发明取上清液至新管，弃磁珠。在本发明中，上清液和磁珠的分离方法优选为：将pcr管置于磁力架上静置。所述静置的时间优选为1～3min，更优选为2min。得到含有上清液的新管后，本发明向含有上清液的新管中加入磁珠液进行反应。优选的，所述反应前将反应液混匀。所述混匀的方式优选为吹吸。在本发明的实施例中，使用200μl移液枪调节至液体总体积的70～80％取量处，反复上下吹吸6～10次，所述吹吸的过程应避免气泡产生。在本发明中，所述磁珠液的添加量为0.7～1.1倍pcr反应体系体积，优选为0.8～1.0倍pcr反应体系体积，更优选为0.9倍pcr反应体系体积。所述反应的时间为1～30min，优选为1.5～5min，更优选为2min。反应结束后，弃上清液，得到磁珠。所述上清液和磁珠的分离方法优选为：将pcr管置于磁力架上静置，所述静置的时间优选为1～4min，更优选为2～3min。得到磁珠后，本发明对磁珠进行清洗纯化。优选的，所述清洗用溶液包括b&w洗液和/或68～72的乙醇水溶液。在用b&w进行清洗纯化时，本发明优选向含有磁珠的管中加入b&w洗液，使磁珠悬浮反应1～3min，优选为2min。反应结束后，磁珠和b&w洗液的分离方法优选为：用强力磁铁或磁力架吸附磁珠至溶液澄清，再用移液器吸取上清，保留磁珠。在本发明中，所述b&w洗液优选包括150～250g/l的peg4000，20～30g/l的nacl和0.5～1.5μmol/l的edta，更优选包括200g/l的peg4000，25g/l的nacl和1μmol/l的edta。所述b&w洗液的清洗用量优选为30～50μl，更优选为40μl。在本步骤中，所述b&w洗液的作用是在pcr反应后，增强磁珠对大片段的吸附效率，以达到去除大片段的目的。在用乙醇水溶液进行清洗纯化时，本发明优选向含有磁珠的管中加入体积浓度68～72％的乙醇水溶液，然后用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮和移动磁珠以充分反应。反应结束后，磁珠和乙醇水溶液的分离方法优选为：用强力磁铁或磁力架吸附磁珠至溶液澄清，再用移液器吸取上清，保留磁珠。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为70％。所述乙醇水溶液的用量优选为90～110μl，更优选为100μl。在本发明中，所述乙醇洗液的作用是去除未被磁珠吸附的盐离子和其他非目的核酸片段。在本发明中，当清洗用溶液包括两种时，优选先用b&w洗液清洗磁珠，再用乙醇水溶液清洗磁珠。清洗顺序能使得到的磁珠中杂质残留最少。乙醇水溶液清洗后，本发明优选将磁珠于室温放置3～10min，使溶液中乙醇完全挥发。得到纯化后的磁球后，本发明对所述纯化后的肺癌初始文库进行第二次pcr扩增，得到肺癌测序文库。在本发明中，所述第二次pcr扩增优选包括上游街头引物和下游街头引物，所述上游街头引物的核苷酸序列优选包括primerf(seqidno.71)所示；所述下游街头引物的核苷酸序列优选包括primerr01～96(seqidno.72～167)。第二次pcr扩增的目的是对纯化后的肺癌初始文库进行加街头和barcode操作。在本发明中，所述第二次pcr优选采用30μl的pcr反应体系，所述pcr反应体系包括10μl反应缓冲液，1μl浓度独立为10μmol/l的dna扩增用上游街头引物，1μl浓度独立为10μmol/l的dna扩增用下游街头引物和余量的水；所述反应缓冲液包括200u/l聚合酶，100mmol/lph8.8的tris-hcl，500mmol/l的kcl，15mmol/l的mgcl2和质量浓度为0.8％的np-40。在本发明中，所述第二次pcr扩增的反应程序优选为：95℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s，6～8个循环；72℃，5min。得到肺癌测序文库后，本发明向装有肺癌测序文库的管中加入磁珠液进行反应。优选的，所述反应前将反应液混匀。所述混匀的方式优选为吹吸。在本发明的实施例中，使用200μl移液枪调节至液体总体积的70～80％取量处，反复上下吹吸6～10次，所述吹吸的过程应避免气泡产生。在本发明中，所述磁珠液的添加量为0.8～1.2倍pcr反应体系体积，优选为0.9～1.1倍pcr反应体系体积，更优选为1.0倍pcr反应体系体积。所述反应的时间为1～30min，优选为1.5～5min，更优选为2min。反应结束后，本发明弃上清液，得到磁珠。在本步骤中，上清液和磁珠的分离方法优选为：将pcr管置于磁力架上静置，所述静置的时间优选为1～3min，更优选为2min。得到磁珠后，本发明对磁珠进行清洗纯化。优选的，所述清洗用溶剂包括b&w洗液和/或乙醇水溶液。在用b&w进行清洗纯化时，本发明优选向含有磁珠的管中加入b&w洗液，使磁珠悬浮反应1～3min，优选为2min。反应结束后，磁珠和b&w洗液的分离方法优选为：用强力磁铁或磁力架吸附磁珠至溶液澄清，再用移液器吸取上清，保留磁珠。在本步骤中，所述b&w洗液包括100～200g/l的peg4000，20～30g/l的nacl和0.5～1.5μmol/l的edta。优选的，所述b&w洗液包括150g/l的peg4000，25g/l的nacl和1μmol/l的edta。所述b&w洗液的清洗用量优选为30～50μl，更优选为40μl。在本步骤中，所述b&w洗液的作用是在pcr反应后，增强磁珠对大片段的吸附效率，以达到去除大片段的目的。在用乙醇水溶液进行清洗纯化时，本发明优选向含有磁珠的管中加入乙醇水溶液，然后用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮和移动磁珠以充分反应。反应结束后，磁珠和乙醇水溶液的分离方法优选为：用强力磁铁或磁力架吸附磁珠至溶液澄清，再用移液器吸取上清，保留磁珠。在本步骤中，所述乙醇水溶液的体积比为68～72％，优选为70％。所述乙醇水溶液的用量优选为90～110μl，更优选为100μl。在本步骤中，所述乙醇洗液的作用是去除未被磁珠吸附的盐离子和其他非目的核酸片段。本发明优选先用b&w洗液清洗磁珠，再用乙醇水溶液清洗磁珠。该清洗顺序能使得到的磁珠中杂质残留最少。乙醇清洗结束后，本发明优选将磁珠于室温放置3～10min，使乙醇完全挥发。磁珠经过清洗纯化后，本发明对磁珠表面的dna进行洗脱，在本发明中，所述洗脱液优选为elutionbuffer。所述elutionbuffer的添加量优选为15～25μl，更优选为20μl。所述elutionbuffer选用10mmtris-edta缓冲溶液(ph＝8.0)。本发明对磁珠表面的dna进行洗脱后，得到的洗脱液即为纯化的肺癌测序文库。本发明优选对得到肺癌测序文库进行文库质控。所述文库质控包括定量质控和片段质控。所述定量质控优选采用荧光定量pcr法进行测定，在本发明的实施例中，所述荧光定量pcr使用商品化试剂盒进行(试剂盒选用康为世纪的dna文库定量试剂盒，商品货号：cw2684m)，具体步骤参见康为世纪的dna文库定量试剂盒试剂盒的说明书。所述片段质控优选采用安捷伦2100进行测定，在本发明的实施例中，所述安捷伦2100生物分析仪上进行，具体步骤参见产品说明书。本发明提供的肺癌高通量文库构建方法操作步骤简便，全过程用时24小时内完成，较现有已知的建库试剂盒(如tumor170测序流程需要48小时，thermofish测序流程需要48小时)用时更短。本发明提供的肺癌高通量文库构建方法利用磁珠反应结合洗涤操作，最大程度保证了纯化的高效和便捷，最终使文库的转化率一般达到95％以上，进而使得10ng的模板作为最低建库模板量足可以满足检测的要求，，非目的片段的去除也得到明显改善。本发明提供了上述构建方法得到的肺癌高通量测序文库，该文库在构建过程中保留了高通量文库构建过程中的各个步骤，采用改变磁珠所处环境以达到对不同片段大小的核酸吸附能力的改变。同时由于全程在一个纯化管中进行，最大程度保证了对模板的利用率，保证了文库的高转化率，转化率一般在95％以上并且高度可重复起始的模板量可以低至10ng；pcr富集过程最大程度的避开了碱基偏好性，从而使得测序均一度好，每次测序的最深读取次数和最低读取次数的比值控制在5倍以内；相对于现有的技术，本发明的文库构建方法最大程度的提高了对模板的利用，减少了文库构建过程中的损失，并且由于全程在一个纯化容器中进行，极大地避免了样品间的交叉污染。本发明还提供了上述肺癌高通量测序文库在体外定性检测非小细胞肺癌(nsclc)患者的石蜡包埋组织切片中egfr、braf、pik3ca、kras、nras、alk、ros1基因的变异中的应用。相对于步骤是在上述步骤的基础上添加了模板制备的步骤，其中gfr、braf、pik3ca、kras、nras的建库需要使用ffpe样品的基因组提取；alk、ros1基因检测需要增加使用ffpe样品的rna提取及反转录步骤。下面结合实施例，对本发明提供的一种肺癌高通量测序文库的构建方法及其产品和应用进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围实施例1一种肺癌高通量测序文库的构建方法，包括初始文库的生成，初始文库的纯化，测序文库的生成，测序文库的纯化。步骤一，初始文库的生成：采用多重pcr对靶向目标片段进行捕获并扩增的方案。具体过程，在0.2mlpcr管中加入0.03ml的反应体系，按照特定反应程序进行扩增，具体反应体系及程序如表1、表2。表1、初始文库的反应体系表2、初始文库扩增程序步骤二、初始文库的纯化：主要由二次磁珠纯化结合二次洗涤组成。二次磁珠纯化中第一次取上清，而第二次则是弃上清具体如下：1.取pcr反应扩增后的原管中加入0.5倍体积ampurexpbeads(30μl体系加15μl)，吹吸混匀。pcr管置于磁力架上于室温静置2分钟后取上清至新的ep管子，弃磁珠。2.向步骤1中上清中加入0.9倍原始pcr体积ampurexpbeads(如pcr体系为30μl，则加27μl磁珠)，吹打混匀。磁力架上于室温静置2-3min，抛弃上清，留磁珠。3.加入40μlb&w洗液(bw13：200g/l的peg4000，25g/l的nacl和1μmol/l的edta)，悬浮磁珠，室温静置2min。用强力磁铁或磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器吸取上清，抛弃上清，保留磁珠。4.加入100μl70％乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠以充分悬浮磁珠便洗涤，抛弃上清，保留磁珠。5.室温放置5分钟，使乙醇完全挥发。步骤三、测序文库的生成：初始文库需要在步骤二获取的带磁珠的ep管进行第二轮pcr，在初始文库基础上完成加街头和barcode从而生成测序文库。具体反应在0.2mlpcr管进行，采用0.03ml反应体系，按特定程序扩增，具体40μl洗液反应体系及程序如表3、表4。表3、测序文库的反应体系成分体积反应缓冲液10μl街头引物上游1μl街头引物下游1μl水18μl表4、测序文库扩增程序步骤四，测序文库纯化由加入1次磁珠吸附后进行2轮洗涤完成，具体步骤如下：1.在第二轮pcr结束的ep管中加入1.0倍体积ampurexpbeads(30μl体系加30μl)，吹打混匀。磁力架上于室温静置2分钟后弃上清，留磁珠。2.原管中加入40μlb&w洗液(bw10：150g/l的peg4000，25g/l的nacl和1μmol/l的edta)，重悬磁珠，室温静置2min。磁力架吸附磁珠后，弃上清，留磁珠。3.仍在原管中加入100μl70％乙醇，充分悬浮磁珠进行洗涤。磁力架吸附磁珠后，弃上清，留磁珠。4.室温放置5分钟，使乙醇挥发。5.加入20μlelutionbuffer，充分悬浮磁珠，室温静置2min以洗脱dna。将磁珠用磁铁吸附，上清dna溶液即为测序文库。步骤五，文库质控，其中文库定量采用荧光定量pcr(试剂盒选用康为世纪的dna文库定量试剂盒，商品货号：cw2684m)，文库的片段质控采用安捷伦2100生物分析仪(芯片及配套试剂选用高灵敏度dna分析试剂盒，商品货号：5067-4626)进行。具体步骤参见相关产品说明书。结果如图1所示：经过本发明提供的方法获得的测序文库，转化率达到原来的95％以上，90％的非目的条带被去除。本实施例提供的肺癌高通量测序文库的构建方法整体用时小于24小时，文库的转化率大95％以上，非目的片段的去除程度达90％以上，最后通过数据分析，对于每个位点的平均深度的0.2乘的比例为100％，对于每个位点的平均深度的0.5乘的比例为100％，把区域覆盖度大于97.74％，即数据分析结果显示文库各片段具有高度均一性。实施例2自动化构建方案第一步，向96孔板的目标孔底部中注入1μl模板，后将96孔板置于96板架上，探头伸入96孔板上部，切换通道至管道a使得管道中充满第一轮pcr反应液，开启通道，向目标孔中注入29μl的第一轮pcr反应液。取下96孔板，贴上密封膜，震荡混匀，离心后置于pcr仪上进行反应。反应液组分如表1，反应条件如表2。第二步，切换管道至管道b使得管道中充满磁珠混合液，从pcr仪上取出第一轮pcr结束的96孔板置于板架上，探头将pcr管顶部刺入停于管上部，注入15μl磁珠，混匀静置5分钟使其充分接触后，置于磁力架上2分钟后使磁珠吸附于底部，吸取上清转移至96孔纯化板。第三步，将96孔板置于板架上，探头将pcr管顶部刺入停于管上部，注入27μl磁珠，开启磁力架电源并反复切换正负极，使得磁珠与反应液混匀，关闭磁力架静置3分钟。再次开启磁力架电源上，使得磁珠吸附于底部一侧，吸取探头深入另一侧，吸取上清。第四步，切换至管道c，使得管道中充满bw13,探头向孔道中注入40μl溶液，悬浮混匀并静置2min。开启磁力架磁力使得磁珠被吸附于管壁一侧，吸附3min，开启吸取探头，于另一侧吸取上清。第五步，切换至管道d，使得管道中充满70％乙醇，开启注入探头向纯化管中注入100μl70％乙醇，反复10次切换磁力架正负极，使得在管壁两侧来回吸附磁珠以保证充分悬浮磁珠。最后磁力停止于一侧，保证磁珠充分吸附于管壁，开启吸取探头，将上清吸取。重复一次。第六步，切换管道e，使得管道中充满空气，开启注射探头使得空气不断注入纯化管，使得磁珠干燥。第七步，切换管道f，使得管道中充满二轮pcr反应液，开启注射探头，注入30μl反应液，切换磁力架正负极，使得磁珠与反应液充分混合。取下96孔板，加封封口膜置于pcr仪上。反应液组分如表3，反应条件如表4。第八步，切换管道至管道b，使得管道中充满磁珠悬浮液，探头刺入密封膜，开启注入探头，注入30μl磁珠悬浮液，切换磁力架正负极，使得磁珠与液体充分混匀后关磁力电源，静置3分钟使得磁珠充分吸附目标核酸片段。开启磁力电源，使得磁珠吸附于一侧管壁。开启吸取探头，将上清吸取。第九步，切换管道至管道f,开启探头向管中注入40μlbw10，切换正负极，使得磁珠与bw10充分混匀，关磁力架电源，静置3min。开启磁力架电源，使得磁珠吸附于一侧管壁，开启吸取探头将上清吸去。第十步，切换管道至管道d，注入70％乙醇溶液100μl，开启磁力架电源并切换正负极使得磁珠与乙醇溶液混匀，最后使得磁珠吸附于一侧管壁，开启吸取探头将上清吸去。第十一步，切换至管道g，开启注入探头，使得空气进入管中，将磁珠干燥。第十二步，切换至管道h，开启注入探头，注入20μl洗脱液，开启磁力架电源，使得洗脱液与洗脱液充分混匀，关磁力架电源静置3分钟后，再次开启磁力架电源，使得磁珠吸附于管壁一侧。开启封口膜，吸取上清，此时上清即为构建好的测序文库。注：如不使用电磁，可以通过移动强力磁铁的距离来完成磁性的切换。以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属
技术领域：
的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。序列表<110>安徽鼎晶生物科技有限公司上海鼎晶生物医药科技股份有限公司<120>一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用<160>167<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cctacacgacgctcttccgatctaggtcaaagaatatggccagaagag48<210>2<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>3<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cctacacgacgctcttccgatcttatggagcaaaactactgtagagcc48<210>4<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>5<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cctacacgacgctcttccgatctttgttgagaaaagagaatgaagccc48<210>6<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agttccttggcacccgagaattccagggaaggcaggaagattttcaatc49<210>7<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cctacacgacgctcttccgatctatttctctactttttcgtgtgctcc48<210>8<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8agttccttggcacccgagaattccacagtgggattgtaacaaccagaaat50<210>9<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cctacacgacgctcttccgatctccattggctcctgtttgaaatgag47<210>10<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10agttccttggcacccgagaattccacagtgggattgtaacaaccagaaat50<210>11<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cctacacgacgctcttccgatctccttaagaacaccatggagaccata48<210>12<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agttccttggcacccgagaattccatctagtaatttgggaatgcctggtt50<210>13<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cctacacgacgctcttccgatctctcagtgaagaactagtccagctt47<210>14<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>15<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cctacacgacgctcttccgatctggctcctgagacctttgataacata48<210>16<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16agttccttggcacccgagaattccatcagctttctcccactgtattgaat50<210>17<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cctacacgacgctcttccgatctggctcctgagacctttgataacata48<210>18<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18agttccttggcacccgagaattccacagtgggattgtaacaaccagaaat50<210>19<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19cctacacgacgctcttccgatctcaggactatgaggagaagacaaaga48<210>20<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agttccttggcacccgagaattccacagtgggattgtaacaaccagaaat50<210>21<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cctacacgacgctcttccgatcttgcagacaagcataaagatgtcatc48<210>22<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22agttccttggcacccgagaattccatacacaatcatgatgccggagaaag50<210>23<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cctacacgacgctcttccgatctgacactgtgcagattttcatccaag48<210>24<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>25<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25cctacacgacgctcttccgatctaagaccttgcagaaataggaattgc48<210>26<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>27<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27cctacacgacgctcttccgatctaatgtctaactcgggagactatgaa48<210>28<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>29<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29cctacacgacgctcttccgatcttgcagacaagcataaagatgtcatc48<210>30<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>31<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31cctacacgacgctcttccgatctatgggatgttattaactggaggagg48<210>32<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>33<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33cctacacgacgctcttccgatctaagatcatgtggcctcagtgaaaaa48<210>34<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34agttccttggcacccgagaattccaaaagcagtagttggggttgtagtc49<210>35<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35cctacacgacgctcttccgatctatctagtttctatccacacagacgg48<210>36<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36agttccttggcacccgagaattccaggttgtagtcggtcatgatggtc48<210>37<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37cctacacgacgctcttccgatctaccgtttgtaccttgatgagttaga48<210>38<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38agttccttggcacccgagaattccacagccaactctttgtcttcgtttat50<210>39<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39cctacacgacgctcttccgatctatttctctactttttcgtgtgctcc48<210>40<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40agttccttggcacccgagaattccaatcttcagctttctcccactgtatt50<210>41<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41cctacacgacgctcttccgatctcatcttcaggtgctggatttttctt48<210>42<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42agttccttggcacccgagaattccacagccaactctttgtcttcgtttat50<210>43<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43cctacacgacgctcttccgatcttactgataaactcaaggaggcagag48<210>44<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44agttccttggcacccgagaattccacagccaactctttgtcttcgtttat50<210>45<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45cctacacgacg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