本发明属于天然药物领域，具体涉及一种来源于异叶三宝木的具有新颖化学结构的stemodane型二萜类化合物的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是一类常见病、多发病，预后差、死亡率高，是严重威胁人类生命和健康的第二号杀手，仅位居心血管疾病之后。现代医学对恶性肿瘤的治疗主要包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗和生物治疗，以化学药物治疗为主，即使采用了手术治疗的方式，往往也需要在手术后常规采用化学药物进行辅助治疗。随着生命科学的飞速发展，恶性肿瘤的发生机制的不断被阐明，新的抗肿瘤作用靶点不断被发现，靶向抑制肿瘤信号转导成为新型抗肿瘤药物开发的重要方向之一。在各种分子靶点中，蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，ptk)是目前研究最多且效果最明显的抗肿瘤药物靶点之一，已成为抗肿瘤靶向治疗药物的研究重点和热点。酪氨酸激酶通过一个复杂的细胞内网络通路控制细胞的增殖、生存、凋亡、血管生成以及侵袭和转移，肿瘤组织最初可能对单靶点酪氨酸激酶抑制剂有反应，但可以通过多种机制(包括自分泌或旁分泌、产生配体、受体突变、激活下游信号通路和启用替代信号等途径)获得拮抗能力，肿瘤存在这些逃逸机制是多靶点治疗必要性的基础。临床实践同样表明，单靶点酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物，如厄洛替尼和吉非替尼，尽管选择性强、毒副作用小，但在使用过程中易产生耐药性，无法彻底杀灭肿瘤细胞，而联合用药又会带来严重的不良反应，影响各自的药动学特性。多靶点酪氨酸激酶抑制剂具有减少药物使用种类，可从多方面发挥效用，对抗耐药性，避免产生药物相互作用，减少不良反应等优点。许多多靶点酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物因其选择性高、疗效好、毒性小的临床特点，已逐渐成为某些肿瘤治疗的一线用药。
大戟科三宝木属(trigonostemon)植物全世界约有50种，分布于亚洲的热带和亚热带地区，我国有10种，产于海南、云南以及广西等南部省区，其中异叶三宝木为海南特植物[中国科学院中国植物志编委会.中国植物志.第44(2)卷.科学出版社.北京:1996,pp162-169.]。三宝木属因富含抗肿瘤活性成分而受到国内外学者的广泛关注，截至目前已从该属多种植物中分离鉴定了大量并具有显著的生物活性的化合物，如生物碱类、二萜类以及菲类等多种类型化合物[tancj,diyt,wangyh,zhangy,siyk,zhangq,gaos,huxj,fangx,lisf,haoxj.threenewindolealkaloidsfromtrigonostemonlii.organiclett.2010,12:2370-2373.；dongsh,liuhb,xuch,dingj,yuejm.constituentsoftrigonostemonheterophyllus.j.nat.prod.2011,74:2576-2581.；dongsh,zhangcr,xuch,dingj,yuejm.daphnane-typediterpenoidsfromtrigonostemonhowii.j.nat.prod.2011,74:1255-1261.；tanggh,zhangy,guyc,lisf,diyt,wangyh,yangcx,zuogy,lisl,hehp,haoxj.trigoflavidolsa–c,degradedditerpenoidswithantimicrobialactivity,fromtrigonostemonflavidus.j.nat.prod.2012,75:996-1000.；tanggh,hehp,guyc,diyt,wangyh,lisf,lisl,zhangy,haoxj.3,4-seco-diterpenoidsfromtrigonostemonflavidus.tetrahedron2012,68:9679-9684.；kaemchantuekp,chokchaisirir,prabpais,kongsaereep,chunglokw,utaipant,chamulitratew,suksamrarna.terpenoidswithpotentantimycobacterialactivityagainstmycobacteriumtuberculosisfromtrigonostemonreidioidesroots.tetrahedron2017,73:1594-1601.]。
异叶三宝木(t.heterophyllus)为大戟科三宝木属植物，为我国特有植物，仅分布于海南岛。截至目前有关异叶三宝木中化学研究及其药理活性的研究报道较为少见，在以前的研究中发现了倍半萜类、二萜类、木脂素类以及菲类衍生物类多种类型的化学成分[dongsh,liuhb,xuch,dingj,yuejm.constituentsoftrigonostemonheterophyllus.j.nat.prod.2011,74:2576–2581.；liyx,meiwl,zuowj,zhaoyx,dongwh,daihf.twonewcompoundsfromtrigonostemonheterophyllus.phytochem.lett.2012,5:41–44.；tanggh,zhangy,guyc,lisf,diyt,wangyh,yangcx,zuogy,lisl,hehp,haoxj.trigoflavidolsa–c,degradedditerpenoidswithantimicrobialactivity,fromtrigonostemonflavidus.j.nat.prod.2012,75:996–1000.；tanggh,hehp,guyc,diyt,wangyh,lisf,lisl,zhangy,haoxj.3,4-seco-diterpenoidsfromtrigonostemonflavidus.tetrahedron2012,68:9679–9684.；liyx,zuowj,lixn,meiwl,daihf.anewlignanglycosidefromtrigonostemonheterophyllus.j.asiannat.prod.res.2014,16:549–553.；liyx,zuowj,meiwl,chenhq,daihf.anewditerpenefromthestemsoftrigonostemonheterophyllus.zhongguotianranyaowu2014,12:297–299.；wangqy,cuigx,wujc,chenyg.steroidsfromtrigonostemonheterophyllus.chem.nat.compd.2015,51:1196–1198.]。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从异叶三宝木枝叶中分离得到的具有新颖化学结构的stemodane型二萜类化合物trigoheteronea，该化合物具有显著的抗肿瘤活性和与阳性对照药相当的蛋白酪氨酸激酶的抑制活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的抗肿瘤药物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种新的stemodane型二萜类化合物，化学名为trigoheteronea，其化学结构如下：
本发明的另一目的是提供一种从异叶三宝木枝叶分离纯化化合物trigoheteronea的制备方法，其步骤如下：
a.将阴干的异叶三宝木枝叶粉碎后用甲醇或85％乙醇溶液提取三次，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；
b.将醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯萃取浸膏；
c.将乙酸乙酯萃取浸膏进行柱色谱分离纯化，得到单体化合物trigoheteronea。
详细步骤c包括：①将乙酸乙酯萃取浸膏经硅胶柱色谱分离，分别按体积比95:5、85:15、70:30、50:50进行石油醚-丙酮梯度洗脱，收集体积比为70:30的石油醚-丙酮洗脱物；②取石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱物用mci树脂柱层析去除色素，用体积比为50:50、75:25、90:10的甲醇-水梯度洗脱，收集体积比为75:25甲醇-水洗脱物；③取甲醇-水(体积比75:25)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用体积比为60:40、70:30、80:20的甲醇-水梯度洗脱，收集体积比为70:30甲醇-水洗脱物浓缩；④取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比为58:42，得到单体化合物trigoheteronea。
本发明的再一目的在于提供stemodane型二萜类化合物trigoheteronea在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是提供stemodane型二萜类化合物trigoheteronea在制备以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物方面的应用。
进一步地，所述肿瘤细胞株包括hl-60(人原髓细胞白血病细胞)、a549(人肺癌细胞)、smmc-7721(人肝癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)和sw480(人结肠癌细胞)等5种肿瘤细胞株。
本发明通过对长序三宝木枝叶中的化学成分进行系统研究，首次从乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定了一个具有新颖化学结构的stemodane型二萜类化合物。多种体外活性评价结果表明：该化合物具有显著的抗肿瘤活性和与阳性对照药相当的蛋白酪氨酸激酶的抑制活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的抗肿瘤药物。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
实施例一：化合物trigoheteronea的制备方法(一)
将阴干的异叶三宝木枝叶(26.2kg，海南)粉碎后用85％乙醇溶液冷浸提取三次，每次提取一周，过滤，收集滤液，减压浓缩得乙醇提取物；将该醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物327.9g；将乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离纯化：将乙酸乙酯萃取浸膏用硅胶柱层析进行分离，石油醚-丙酮梯度洗脱(95:5、85:15、70:30和50:50)，收集石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱物，取石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱物用mci树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比50:50、75:25和90:10)，收集甲醇-水(体积比75:25)洗脱物，取甲醇-水(体积比75:25)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用(体积比60:40、70:30和80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比58:42)得到纯的化合物trigoheteronea(108.9mg)。
结构确证：通过旋光光谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和质谱等多种现代波谱技术的综合解析，确定了化合物trigoheteronea的化学结构。
trigoheteronea:白色无定形粉末,
表1化合物trigoheteronea的1h和13cnmr数据(cdcl3)
ameasuredat400mhz.
bmeasuredat100mhz.
实施例二：化合物trigoheteronea的制备方法(二)
将阴干的异叶三宝木枝叶(100.8kg，海南)粉碎后用甲醇冷浸提取三次，每次3天，过滤，收集滤液，减压浓缩得乙醇提取物。将甲醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物1386.2g；将乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离纯化：将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析进行分离，石油醚-丙酮梯度洗脱(95:5、85:15、70:30和50:50)，收集石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱物，取石油醚-丙酮(体积比70:30)洗脱物用mci树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比50:50、75:25和90:10)，收集甲醇-水(体积比75:25)洗脱物，取甲醇-水(体积比75:25)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用(体积比60:40、70:30和80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比58:42)得到单体化合物ii(489.8mg)。
化合物ii的结构确证：白色无定形粉末；hr-esims显示化合物ii的[m+h]+为m/z303.2318；化合物ii与实施例一中制备方法得到的化合物trigoheteronea共tlc，在三种展开体系下[石油醚-丙酮(6:4)、石油醚-乙酸乙酯(5:5)和氯仿-丙酮(7:3)]均为均一斑点，说明该化合物与化合物trigoheteronea为同一化合物。
实施例三：化合物trigoheteronea的抗肿瘤活性研究
1、实验方法：将五种常见肿瘤细胞株hl-60、a549、smmc-7721、mcf-7和sw480分别用含10％小牛血清的rpmi-1640培养基，在37℃、5％co2培养箱中培养。采用mtt法进行细胞增殖抑制试验，主要操作为：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25％的胰蛋白酶消化，10％新生小牛血清的rpmi-1640培养液调制成5×104个/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180μl。在37℃,5％co2饱和湿度条件下培养8-10h，待其贴壁，每个孔加入用pbs配制的样品液，使得样品终浓度分别为0.1,1,和10μg/ml。每个浓度平行3孔，继续培养44h后，每孔加入50μlmtt(1mg/ml-1，pbs配制)，在37℃,5％co2条件下继续温育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μldmso，在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组(仅加入含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)＝(1-实验组3孔od值平均值/对照组3孔od值平均值)×100％。以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品ic50值。采用spss13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。
2、抗肿瘤活性实验结果(见表2)
由实施例一得到的化合物trigoheteronea对所选肿瘤细胞株hl-60、a549、smmc-7721、mcf-7和sw480均显示不同程度的增殖抑制活性。
表2化合物trigoheteronea的抗肿瘤活性评价结果
实施例四：化合物trigoheteronea的抑制蛋白酪氨酸激酶活性
大鼠脑组织中ptks的提取：将大鼠大脑取出，剔除脑膜，称重，加入4倍量的冷匀浆液。冰浴中用玻璃匀浆器高速匀浆，离心，收集上清液，再离心10min。收集上清液，上清液中含有胞浆型酪氨酸激酶，而沉淀可作为受体型酪氨酸激酶使用。留取少量上清液用于提取物中蛋白质的含量测定，其余分装，置于-70℃保存备用。
酶标板包被：将底物稀释液加入96孔酶标板中(每孔125μl)，37℃孵育过夜。移除板中过量底物液，加入磷酸盐缓冲液(pbs-tween20)洗涤，于37℃干燥2h。4℃保存备用。
ptk抑制剂评价：先将样品加入酶标板中，37℃孵育，加入用激酶缓冲液稀释的atp，37℃孵育，移除板中的反应液，洗涤；加入抗体复合物，37℃孵育；移除板中抗体复合物，洗涤，加入四甲基联苯胺(tmb)显色液，室温避光反应，加入终止液，于450nm波长处测定吸光度(a)值。阳性对照药为伊马替尼。按下述公式计算化合物trigoheteronea的抑制率：抑制率％＝(a正常-a样品)/(a正常-a空白)*100％
结果表明，化合物trigoheteronea对蛋白酪氨酸激酶具有显著的抑制作用(抑制率78.26％)，抑制活性和阳性对照药伊马替尼的抑制活性相当(抑制率71.68％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。