一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂的制作方法

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂。

背景技术

鸭乙型肝炎病毒(duckhepatitisbvirus,dhbv)与人类乙型肝炎病毒(hbv)同属嗜肝dna病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面均较为相似，dhbv病毒颗粒为球形，有囊膜，直径40-50nm，经卵垂直传播，所以雏鸭感染率最高，感染后无临床症状，但有报道认为其感染可引起肝细胞变性和点灶状坏死，汇管区炎性细胞浸润等肝炎样病理改变。dhbv感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。与人hbv一样，鸭血清中的dhbv-dna的滴度是病毒复制活动最直接、最可靠的标志。通过检测血清中肝炎病毒dna滴度，可以分析病毒在体内的复制活动情况，从而为研究病毒性肝炎的发病机理、评价和预测抗病毒药物的疗效提供重要依据。

核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一，目前核酸扩增的方法有聚合酶链式反应(pcr)、依赖核酸序列扩增(nasba)、自主序列复制(sr)以及链置换技术(sda)等，都能将微量标本进行快速扩增，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面各有缺点。本研究所涉及的环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)检测方法是2000年由日本notomi等人开发出来的一种体外核酸扩增的新型技术，它能够在1h内，水浴锅环境等温条件下，把拷贝数很低的dna片段扩增到10⁹个拷贝。反应过程中，由于反应溶液中的mg²⁺与dntp析出的焦磷酸根离子结合产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，因此，仅用肉眼观察或使用浊度仪检测浊度就可以判读结果，浊度仪还可以对起始模板定量，这是最常用、最简单的检测方法。

环介导等温扩增技术是当前应用最为广泛的一种核酸快速扩增的新型技术之一，与主流的pcr技术有着根本不同的设计思路，其特点是分别使用对应于靶序列中6个基因区段的2对特殊引物(外引物f3,b3；内引物fip,bip)，利用bstdnapolymerase在延伸dna同时的链置换活性，对目的片段进行链置换扩增，不需要双链dna模板的预变性、退火及繁琐的循环变温过程，整个反应在恒温条件(61～65℃左右)下几十分钟即可完成核酸扩增，扩增效率一般高达到10⁹-10¹⁰个数量级，大量的核酸产物可使反应结果通过在终产物中加入核酸染料的方法直接用肉眼观察。随着研究人员对lamp技术认识的深入，lamp技术还在快速地发展与优化，在疾病致病原基因诊断、食品安全分析和环境监测等领域发挥着越来越重要的作用。由于lamp检测技术在各项检测上的优越性，人们已经将它广泛应用到病原体检测、动物胚胎性别的鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测等各个领域，lamp检测技术具有非常高的应用价值。lamp检测技术操作简单、用时短、准确率高，相当适合养殖场现场操作，这项技术的应用将大大降低畜牧业的发展成本，减少其经济损失，从而提供相当高的经济效益。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。

技术实现要素：

为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本发明的目的在于提供一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂，应用该试剂进行检测时，检测时间短，特异性和敏感性高，操作方便且成本低。

本发明的第一个目的是提供用于检测鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增引物组，所述引物组由以下引物组成：

上游内引物fip：caragaaatcctgggcatcccc-gaattc-ctggagcccaaayctcwcc；

下游内引物bip：tgctagtagcagcaggctygc-ackcccattggagctttcct；

上游外引物f3：tgcaatgcgytttccaaga；

下游外引物b3：gagaaaagggctgagaccg；

其中，r、y、w、k为简并碱基，r为g/a，y为c/t，w为t/a，k为g/t。

本发明的第二个目的是提供一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。

作为优选，所述试剂还包括如下组分：10×bstbuffer反应缓冲液、dntps、mg²⁺、bstdna聚合酶、去离子水、模板dna和显色试剂。

作为优选，所述试剂中mg²⁺的浓度为6mm。

作为优选，所述试剂中dntps的浓度为1.5mm；作为优选，所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。

作为优选，所述试剂还包括阳性对照。

本发明的第三个目的是提供一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的环介导等温扩增检测试剂。

本发明的第四个目的是提供上述的检测试剂或检测试剂盒在如下任一中的应用：

(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测鸭乙型肝炎病毒；

(2)制备用于检测或辅助检测鸭乙型肝炎病毒的产品；

(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染鸭乙型肝炎病毒；

(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染鸭乙型肝炎病毒的产品；

(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为鸭乙型肝炎病毒；

(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为鸭乙型肝炎病毒的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染鸭乙型肝炎病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测动物样品中提取基因组dna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为恒温65℃作用1小时；

(2)按照下述任一方法确定待测动物样品是否感染鸭乙型肝炎病毒：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测动物样品感染鸭乙型肝炎病毒；扩增产物呈现紫红色则待测动物样品未感染鸭乙型肝炎病毒；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物样品感染鸭乙型肝炎病毒；仅有一条电泳条带，则待测动物样品未感染鸭乙型肝炎病毒。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒为鸭乙型肝炎病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：

(1)从待测病毒中提取基因组dna作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为恒温65℃作用1小时；

(2)按照下述任一方法确定待测病毒是否为鸭乙型肝炎病毒：

a、扩增产物呈现橙黄色则待测病毒是鸭乙型肝炎病毒；扩增产物呈现紫红色则待测病毒不是鸭乙型肝炎病毒；

b、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病毒是鸭乙型肝炎病毒；仅有一条电泳条带，则待测病毒不是鸭乙型肝炎病毒。

本发明的有益效果如下：

1.本发明使用两对特异性引物，四个识别区域，相对现有的检测方法，特异性更高。

2.本发明检测鸭乙型肝炎病毒的的环介导等温试剂盒具有高灵敏性：将抽提出的鸭乙型肝炎病毒dna进行10倍递进稀释后作为lamp反应模板，以同样的模板浓度用pcr方法进行检测，结果表明：lamp方法比常规pcr扩增的方法至少高10倍。由此可见，本发明lamp方法具有更高的灵敏度。

本发明检测鸭乙型肝炎病毒的的环介导等温试剂盒具有高特异性：将临床上常见的禽类病毒性疾病：mdpv(番鸭细小病毒)及dev(鸭瘟)、h9aiv(禽流感病毒)、dhvⅰ(ⅰ型病毒性肝炎病毒)和mdrv(番鸭呼肠孤病毒)和dhbv分别作为检测对象，用本发明的方法进行检测，仅dhbv为阳性，具有高特异性。

本发明检测鸭乙型肝炎病毒的的环介导等温试剂具有快速性：相对普通pcr反应数小时的反应时间和检测时间，本发明检测方法仅需1个小时即可完成整个反应和结果判定。

本发明检测鸭乙型肝炎病毒的的环介导等温试剂具有可操作性：相对于常规pcr，鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩检测试剂盒不需要昂贵的pcr仪，只需要一个简单的恒温水浴锅即可完成反应；且结果的检测可以直接肉眼判定，无需凝胶电泳等特殊仪器，因此本发明试剂盒具有较强的可操作性。

3.本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为dhbvs基因保守区lamp扩增图。

图2为lamp添加核酸染料的变色结果(此染料为反应前加入)图。

图3为dhbvlamp反应特异性试验图。

图4为dhbvlamp反应产物的酶切鉴定结果图。

图5为dhbvlamp反应灵敏度试验图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、试剂相关材料

鸭乙型肝炎病毒为实验室分离保存毒株。病毒基因组dna/rna提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，betaine(sigma公司)，bstdna聚合酶及10×bstbuffer反应缓冲液(biolabsinc公司)，dntp(clontech公司)，mg²⁺及dl2000(takara公司)。显色试剂为0.025mm酚红和0.08mm甲酚红混合染色液，均购自solarbio公司。

2、lamp引物的设计与合成

参考目前已发表的鸭乙型肝炎病毒序列，针对dhbv病毒属的保守区域s区域，利用在线设计软件primerexplorerv4分别设计4条引物(f1c和b1c分别与扩增下游的f1区和b1区反向互补，以利于成环和链置换反应的进行)，引物包括上游内引物fip(fip由f1c、f2和gaattc(ecorⅰ酶切位点序列)作为连接子组成)、下游内引物bip(bip由b1c、b2组成)，此为利于后续扩增产物的酶切鉴定、上游外引物f3和下游外引物b3，序列分别如下：

fip：caragaaatcctgggcatcccc-gaattc-ctggagcccaaayctcwcc；

bip：tgctagtagcagcaggctygc-ackcccattggagctttcct；

f3：tgcaatgcgytttccaaga；

b3：gagaaaagggctgagaccg。

其中，r、y、w、k为简并碱基，r为g/a，y为c/t，w为t/a，k为g/t。

其中：fip由f1c和f2和gaattc(ecorⅰ酶切位点序列)组成；

bip由b1c、b2组成。

f1c：caragaaatcctgggcatcccc；f2：ctggagcccaaayctcwcc。

b1c：tgctagtagcagcaggctygc；b2：ackcccattggagctttcct。

设计完成的引物由北京奥科生物工程公司合成，合成后的引物用超纯水稀释成10mmol/ml溶液，-20℃保存。

3、病毒基因组提取

利用北京全式金生物技术有限公司的病毒基因组dna/rna提取试剂盒，提取细胞培养鸭乙型肝炎病毒液、疑似有鸭乙型肝炎病毒感染的患病动物组织样品、特异性对照病毒样品的病毒基因组dna。

4、鸭乙型肝炎病毒lamp反应体系的建立

鸭乙型肝炎病毒检测试剂包括如下组分：

其中，阳性对照为鸭乙型肝炎病毒样品的基因组dna。

将上述组分混匀后放置于pcr仪内或者水浴锅中恒温65℃作用1小时；反应结束后，可以将扩增产物用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测，电泳条件为80v、30min；也可直接肉眼观察其颜色变色，两者判定结果一致。肉眼观察时，阳性结果显示为橙黄色，阴性结果显示为紫红色。

电泳检测结果如图1所示，电泳条带呈梯状分布，与理论结果相符，阴性对照的扩增结果只有引物二聚体出现。图2的a和b分别显示了lamp扩增结果的肉眼可观察，自然光下阳性管为橙黄色，而阴性管保持紫红色。

图1为dhbvs基因保守区lamp扩增图。其中m：dna分子量标准dl2000；1：dhbv毒株扩增结果；2：阴性对照。

图2为lamp添加核酸染料的变色结果(此染料为反应前加入)图。其中a：阳性扩增产物；b：阴性对照。

5、鸭乙型肝炎病毒lamp检测方法条件的优化

5.1反应时间优化

配置反应体系，每个时间条件的样品设置3个重复，分别在恒温水浴锅中反应30min、40min、50min、60min后取出，待反应产物全部取出后，各取5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳对反应产物进行检测。

5.2反应温度的优化

配置反应体系，每个温度条件样品设置3个重复，分别在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃五个反应温度中反应1小时后，反应结束后各取5μl产物进行2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)电泳检测。

5.3反应中各重要组分浓度的优化

在25μl反应体系中，引物浓度、反应所需酶单位与所用模板浓度不变，改变组分mgso4的浓度，摸索mgso4浓度对扩增效率的影响，加入量依次为为7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0mm，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测；设置不同dntps浓度的反应体系优化，其梯度设置为1.8mm、1.5mm、1.2mm、0.9mm、0.6mm，所有分组反应都以去离子水作为模板设阴性对照，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。

6、鸭乙型肝炎病毒lamp检测方法的优化结果

6.1反应时间优化结果：当反应时间不同时，会随着时间延伸电泳条带越来越明显，在恒温水浴锅中反应60min时，结果最佳。

6.2反应温度优化结果：当反应温度不同时，会出现电泳条带亮度差异，在65℃下反应时，效果最佳。

6.3反应中各重要组分浓度的优化结果：

当mgso4浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当mgso4浓度为6mm时，效果最佳。

当dntps浓度不同时，会出现电泳条带亮度差异，当dntps浓度为1.5mm时，效果最佳。

6.4优化体系和条件

通过上述条件的优化，鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒的最后优化的体系为：

环介导等温扩增的反应条件为65℃作用1h。

6.225μl检测体系的鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒包括如下组分：

7、lamp的特异性试验

以临床上常见的禽类病毒性疾病：mdpv(番鸭细小病毒)的dna及dev(鸭瘟)、h9aiv(禽流感病毒)、dhvⅰ(ⅰ型病毒性肝炎病毒)和mdrv(番鸭呼肠孤病毒)反转录获得的cdna为检测对象，用dhbv引物进行lamp检测，来验证其反应的特异性，并设置阳性对照，结果参见图3。

lamp检测的反应体系包括如下组分：

其中，鸭乙型肝炎病毒模板dna为使用病毒dna/rna提取试剂盒提取的鸭乙型肝炎病毒基因组dna。

扩增结果显示只有阳性对照出现弥散状条带，其他5种病毒均未出现，说明以其它病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明设计的dhbvlamp引物具有高度的特异性。

图3为dhbvlamp反应特异性试验图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；泳道1～6分别为dhbvlamp特异性引物检测dev、nd、mdpv、h9aiv、mdrv和dhbv的结果。

7.1扩增产物的酶切鉴定

为进一步验证扩增反应的特异性，将lamp反应后产物进行酶切鉴定，在20μl反应体系中加入以下组分，用ecorⅰ对阳性lamp产物进行消化。

将上述反应产物混匀后，37℃反应2h，反应后取出5μl产物，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml的溴化乙锭)对酶切产物进行检测。

结果：理论计算中，dhbv扩增产物经内切酶ecorⅰ消化后，应成为三条大小分别为207bp，234bp和312bp的主带。图4中结果与理论值完全相符，说明本发明建立的检测方法具有很好的特异性。

图4为dhbvlamp反应产物的酶切鉴定结果图。其中m：dna分子标准量标准dl2000；1：dhbvlamp终产物；2：内切酶ecorⅰ消化后的结果。

8、lamp的敏感性试验

取抽提出的病毒液dna产物进行10倍递进稀释至10^-7，并分成两部分，一部分用优化后的lamp方法检测，加入酚红染色液后直接肉眼观察，测定该方法的敏感性；另一部分用常规pcr方法检测，将两者检测结果进行比较，参见图5的a和b图，以验证其反应的敏感性。

结果表明：lamp方法比常规pcr扩增的方法至少高10倍。由此可见，本发明lamp方法具有更高的敏感性。

图5为dhbvlamp反应灵敏度试验图，其中m：dna分子标准量标准dl2000；a、b图中1～6泳道分别为模板稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，7为阴性对照。

9、lamp实际应用的符合性

临床采集疑似鸭乙型肝炎的组织病样，提取样品基因组，利用建立的的lamp检测方法和常规的pcr以及荧光定量pcr方法进行检测，通过对三种方法实际应用中检测结果比较，验证lamp的符合性。

结果表明：利用鸭乙型肝炎病毒环介导等温扩检测试剂盒和常规pcr以及荧光定量pcr对获得的样品进行检测，发现lamp的检出率显著高于传统的pcr方法，与荧光定量pcr方法出率较为相近，且传统的pcr和荧光定量pcr检出的阳性样品都可以被lamp方法所检出。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。