本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬生疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。
背景技术：
在世界范围内已经报道的疫霉约有100种，我国约有27种，随着近几年我国水果及其种苗进口量上升，也大大增加了检疫性疫霉入侵的风险。冬生疫霉(phytophthorasyringae)、冬生疫霉(p.hibernalis)、栗疫霉黑水病菌(p.cambivora)、草莓疫霉红心病菌(p.fragariae)、树莓疫霉根腐病菌(p.fragariae)这5种疫霉为我国禁止入境的检疫性疫霉，其中冬生疫霉在澳大利亚西部的柑橘果实上首次被发现，目前主要分布在以色列、土耳其、南非、法国、英国、西班牙、希腊、意大利、美国、葡萄牙、澳大利亚、新西兰、斐济、多巴哥、委内瑞拉，在我国尚未分布，其传播速度快、流行性广、毁灭性高，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，一旦传入我国将对国内水果贸易及出口销售造成巨大障碍。冬生疫霉主要侵染柑橘属及苹果属植物，如脐橙、柠檬、苹果等，可引起果实褐腐；同时还可侵染如甜椒、番茄、玫瑰、杜鹃、贝壳杉等，造成寄主植物枯萎、根腐或溃疡。该病菌属于低温型有害病菌，其卵孢子可在发病组织和土壤中越冬，第二年气温上升、雨量增加时开始活动，其孢子囊会释放游动孢子随雨水飞溅到近地面的果实上并从伤口侵入从而导致果实发病造成大量脱蒂落果。该种疫霉在寒冷高湿季节危害严重，在田间及贮运期间均能发病，发病果实腐烂后易引起与其他病菌如酸腐病菌和青霉菌的复合侵染，大大增加了检疫及防治难度。冬生疫霉属于卵菌门(oomycota)、卵菌纲(oomycetes)、霜霉目(peronosporales)、腐霉科(pythiaceae)、疫霉属(phytophthora)。冬生疫霉引起的植物病害分布广泛，所以建立冬生疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。
传统的冬生疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在冬生疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，pcr技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然pcr法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时pcr方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代pcr的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于lamp反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自lamp检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，冬生疫霉的检测国内外均未见报道。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中冬生疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种冬生疫霉的lamp检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述冬生疫霉的lamp检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上述冬生疫霉的lamp检测方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测冬生疫霉的lamp引物组合物，由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3和反向环引物lb组成；各引物序列具体如下：
fip：5′-caccgcggtagtagctgcttg-acttttgtagtgggacacgg-3′；
bip：5′-gtgacggaccaggagtcgttcaa-tctagagctgggacgca-3′；
f3：5′-caacgaacacgcagctaac-3′；
b3：5′-ccttccgcgagatttcca-3′；
lb：5′-aagcagtggctgcatgaga-3′
所述的lamp引物组合物在检测冬生疫霉中的应用。
一种检测冬生疫霉的lamp试剂盒，包含体积为1次用量以上的检测溶液，在1ml的检测溶液中，包括：32mm正向内引物fip、32mm反向内引物bip、8mm正向外引物f3、8mm反向外引物b3、8mm环引物lb、50mmdntps、0.8mtris-hc、0.4mmkcl、0.4mm(nh4)2so4、0.24mmmgso4、4％tritonx-100、bstdnapolymerase320单位，200mm羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：
fip：5′-caccgcggtagtagctgcttg-acttttgtagtgggacacgg-3′；
bip：5′-gtgacggaccaggagtcgttcaa-tctagagctgggacgca-3′；
f3：5′-caacgaacacgcagctaac-3′；
b3：5′-ccttccgcgagatttcca-3′；
lb：5′-aagcagtggctgcatgaga-3′
所述的检测冬生疫霉的lamp试剂盒在检测冬生疫霉中的应用。
一种检测冬生疫霉的方法，提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，利用权利要求1所述的lamp引物组合物或权利要求3所述的lamp试剂盒进行lamp；观察lamp反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在冬生疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在冬生疫霉。
所述的检测冬生疫霉的方法：提取待检微生物的dna，取2μldna溶液，加入23μllamp试剂盒中的检测溶液进行lamp，lamp反应程序为：64℃，60min，扩增产物进行颜色变化的观察。
本发明的检测冬生疫霉的方法，包括提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，利用所述的lamp引物组合物进行lamp；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphtholblue，hnb)属于金属离子指示剂的一种。hnb是mg2+的滴定剂，其颜色随溶液ph变化而改变，因此可以通过监测lamp反应体系中mg2+浓度的变化及溶液ph而起到颜色指示剂的作用。反应前将hnb加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中mg2+与lamp反应的副产物p2o74-结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断冬生疫霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在冬生疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在冬生疫霉。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：
1)准确性高：由于传统冬生疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检测对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明根据冬生疫霉的特有的一段基因序列设计特异性的lamp引物。lamp反应通过5条引物(fip、bip、f3、b3、lb)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外，反向环引物lb能够提高反应速率，和其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行冬生疫霉检测。
2)操作方便：本发明提供的检测冬生疫霉的lamp方法克服了现有技术中冬生疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测冬生疫霉的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到冬生疫霉，不需要复杂仪器，能较好满足对冬生疫霉的现场检测。
3)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过hnb的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。
4)实现了恒温扩增，不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用的范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在bstdna聚合酶的作用下实现扩增。
5)本发明为冬生疫霉的检测提供了新的技术平台，可用于冬生疫霉的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，同时能够对田间土壤中的病原物进行检测。本发明对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。
附图说明
图1是颜色判定lamp检测冬生疫霉的种间特异性显色图；图中显示第1管以及第2管显天蓝色，呈阳性；第3-9管显紫色，呈阴性。其中，1，苎麻疫霉(p.boehmeriae)2，冬生疫霉(p.hibernalis)；3，樟疫霉(p.cinnamomi)；4，辣椒疫霉(p.capsici)；5，掘氏疫霉(p.drechsleri)；6，致病疫霉(p.infestans)；7，草莓疫霉(p.fragariae)；；8，阴性对照；
图2是颜色判定lamp检测冬生疫霉的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，成像观察扩增条带，图中显示冬生疫霉菌菌株反应管中的反应液出现了典型梯形状条带，而阴性对照菌反应管中的反应液没有出现梯形条带。其中，1，苎麻疫霉(p.boehmeriae)2，冬生疫霉(p.hibernalis)；3，樟疫霉(p.cinnamomi)；4，辣椒疫霉(p.capsici)；5，掘氏疫霉(p.drechsleri)；6，致病疫霉(p.infestans)；7，草莓疫霉(p.fragariae)；；8，阴性对照；
图3是颜色判定lamp检测冬生疫霉的特异性显色图。图中显示第1管显天蓝色，呈阳性；第2-8管显紫色，呈阴性。其中，1，冬生疫霉(p.hibernalis)；2，平头炭疽菌(colletotrichumtruncatum)；3，茄镰刀(fuariumsolani)；4，稻瘟病菌(magnaporthegrisea)；5，立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；6，大丽轮枝菌(verticiliumdahliae)；7，终极腐霉(pythiumultimum)；8阴性对照；
图4是颜色判定lamp检测冬生疫霉的灵敏度显色图；25μl的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg冬生疫霉dna的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25μl的反应体系中分别含有1pg、100fg、10fg、1fg冬生疫霉dna的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明lamp反应的灵敏度达到10pg。
图5是人工接种发病组织验证lamp结果图；hnb显色反应表明人工接种的柚子提取的dna进行lamp反应后出现了典型梯形状条带，而阴性对照菌反应管和健康柚子组织dna中的反应液没有出现梯形条带(2％琼脂糖凝胶电泳检测：1.阴性对照；2.发病组织样本；3.健康组织样本)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。
实施例1
一种用于检测冬生疫霉的lamp检测试剂盒，由1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、0.2μm反向环引物lb、1.25mmdntps、20mmph8.8的tris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、6mmmgso4、0.1％tritonx-100、bstdnapolymerase16单位、5mm羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成25ul检测溶液。各引物序列具体如下：
fip：5′-caccgcggtagtagctgcttg-acttttgtagtgggacacgg-3′；
bip：5′-gtgacggaccaggagtcgttcaa-tctagagctgggacgca-3′；
f3：5′-caacgaacacgcagctaac-3′；
b3：5′-ccttccgcgagatttcca-3′；
lb：5′-aagcagtggctgcatgaga-3′
实施例2冬生疫霉lamp反应的特异性试验
为了验证冬生疫霉的特异性引物序列，本实施例以1株冬生疫霉菌株和11种其它卵菌以及21种病原真菌为供试材料(表1)，采用ctab法提取发病组织中冬生疫霉的dna。取1μldna溶液，加入23μl实施例1制备的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行环介导等温扩增反应，反应程序为：64℃60min。
提取各供试材料的dna的具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μl2％ctab提取液和90μl10％sds，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mnaac(ph5.2)，-20℃沉淀(＞1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或te(ph8.0)溶解沉淀(含20μg/mlrnase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表1用于检测冬生疫霉特异性的真菌和卵菌菌株
lamp检测结果如图1、图2和图3所示，显示1株冬生疫霉菌株可观察到天蓝色的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现lamp阶梯状的条带，其余12种卵菌以及21种病原真菌显色结果为紫色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。结果显示扩增冬生疫霉的dna模板时，呈现天蓝色并且呈现梯形条带(图1)；扩增与冬生疫霉不同种、不同属的菌的dna模板时，冬生疫霉为天蓝色，其他菌和阴性对照都呈现紫色。
实施例3冬生疫霉lamp反应的灵敏度试验
为了确定lamp检测方法的灵敏度，将提取的冬生疫霉的dna用分光光度计测定浓度(1μg/μl)后用depc水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度dna稀释液1μl作为模板，加入23μl实施例1制备的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行lamp反应，反应程序为：64℃60min。取2μl扩增产物上样，结果如图3所示，显示hnb显色反应表明lamp反应的灵敏度达到10pg的冬生疫霉的dna。
实施例4冬生疫霉环介导等温扩增反应引物特异性验证和灵敏度验证
针对冬生疫霉的环介导等温扩增引物组，共设计了8组符合条件的引物，最终筛选出1组最为特异并灵敏度极高的引物即实施例1中所使用的引物组合物(包括正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3和反向环引物lb)。采用设计的其余引物(随机从剩余8组引物中选1组)，引物序列如下：
fip-1：
5′-caccgcggtagtagctgcttg-acttttgtagtgggacacgg-3′；
bip-1：
5′-gtgacggaccaggagtcgttcaa-tctagagctgggacgca-3′；
f3-1：5′-caacgaacacgcagctaac-3′；
b3-1：5′-ccttccgcgagatttcca-3′；
lb-1：5′-aagcagtggctgcatgaga-3′；
以实施例2中所采用的菌株为供试材料(1株丁香疫霉菌株和14种其它卵菌以及17种病原真菌)，环介导等温扩增检测结果显示剩余所选引物的特异性不高，灵敏度也较差，说明实施例1用于本发明引物组合物具有较高的特异性和灵敏度。
实施例5活体组织中冬生疫霉的lamp检测
当用于发病组织中存在冬生疫霉时，采用naoh快速裂解法提取冬生疫霉的dna，具体过程为：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μl0.5mnaoh，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的ep管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl0.1mmtris(ph8.0)，混匀后取1μl直接用于pcr反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无pcr抑制物存在。
采用上述方法，用直径5nm打孔器在柚子表面打一个深5mm的孔，将v8培养7d后的菌丝块放入孔中，同时进行保湿培养。取3个接种冬生疫霉菌6d后的柚子果肉组织样本，每份样本取2g病健交接处的组织，碾碎后每毫克组织加入10μl0.5mnaoh，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的ep管中，12000rpm离心10min，取5μl上清液加入495μl0.1mmtris(ph8.0)，混匀后取1μl直接用于lamp扩增。将冬生疫霉菌株dna作为阳性对照，以灭菌水作为阴性对照，同时提取健康柚子组织dna作为参照。
如图5所示，在反应结束后，只有发病组织dna的pcr管中出现天蓝色阳性反应，2％琼脂糖凝胶电泳检测出现梯型条带，而阴性对照和健康组织dna的pcr管中没有颜色变化，电泳检测也没有出现梯型条带。