本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种牛及其早期胚胎性别鉴定方法，是现有技术的优化升级及完美补充。
背景技术：
动物的某些生产性状受性别限制或受性别影响，如奶牛只有母牛才表现产奶性状，而肉牛生产中公畜因为生长速度快而具有较高的经济价值，为充分发挥奶牛的繁殖能力和公牛的生长优势，人为地控制牛的性别一直是人们追求的目标，因此快速准确地鉴别家畜早期胚胎性别并实施性别控制技术，是提高畜牧业经济效益的重要措施.以往的pcr性别鉴定均采用持家基因作为内标引物，利用性别特异的sry基因设计引物进行双重pcr扩增分析，并且多采用巢式pcr(nested-pcr)或基因组预扩增的方法对dna模板进行富集，操作繁琐，费时费力，易污染，技术难度较大，不便于现场操作。而单重pcr法由于仅扩增y染色体特异引物，避免了多重pcr中常染色体引物对y染色体特异引物扩增的影响，方法简便，但由于反应中没有内标引物作为内部标记，就可能将没有发生反应的样品误判为雌性，从而增加了鉴别结果假阴性的几率，传统的pcr法对胚胎样本的需求量高，胚胎细胞数目较少的情况下，样本处理后得到的模板很难都达到pcr扩增对模板的要求，就是巢式pcr扩增对于模板较低的情况扩增效果也不好，主要是因为普通pcr方法对模板浓度有一定要求，检测灵敏度低，电泳检测容易出现污染，因此开发一种检测灵敏度高，检出率和准确率高的牛胚胎鉴定复合体系成为当前的主要任务。技术实现要素：本发明目的在于提供一种可检测牛及其早期胚胎性别的复合探针体系，该方法结合运用thermofisher公司quantstudiotm6flex荧光定量检测仪器进行，检测周期短，检测灵敏度高，检出率及准确率高。本发明的另一个目的在于提供一种利用上述引物及探针检测牛及其早期胚胎性别的荧光定量pcr检测的复合探针体系，消除了常规pcr方法及巢式pcr方法电泳所带来的污染。本发明针对牛折叠蛋白基因是x染色体上共有的基因，因此可以将其作为牛的内参基因，用于检测所送样本是否为牛；而sry基因是y染色体上特有的基因，可以用来鉴定公牛的存在与否，二者结合就可以实现牛及早期胚胎的性别鉴定。牛及其早期胚胎性别鉴定的pcr体系，其特征在于：pcr体系中包含有下列引物及探针，内标引物nb2-f：cgggactggactgggat，内标引物nb2-r：ctgactctacgactgtct，内标探针nb2-p：cctcgcatgcagct；性别位点sry基因引物bov97m-f：aaccagtggctagcagcatcaa，性别位点sry基因引物bov97m-r：ttaggaatctatattgcagctt，性别位点sry基因探针bov97m-p：ctgctcgatagcaacc。所述pcr体系为荧光定量pcr体系，在探针上连接有荧光标记：内标探针nb2-p：hex-cctcgcatgcagct-mgb；性别位点sry基因探针bov97m-p：fam-ctgctcgatagcaacc-mgb。所述荧光定量pcr体系总体积为15μl，其中5.2ul的mix+rox,1.2ul的引物及探针混合物、5.6ul的待测dna，和3ul的水。其中引物nb2-f：引物nb2-r：探针nb2-p：引物bov97m-f：引物bov97m-r：探针bov97m-p的用量为1:1:1.25:1:1:25。牛及其早期胚胎性别鉴定的pcr方法，包括检测步骤和判定步骤，其中检测步骤包括将上述体系进行pcr扩增。pcr扩增的反应程序为：95℃3min；然后95℃30s，58℃40s，循环45次。所述pcr扩增为荧光定量pcr扩增。所述判定步骤为：只有两组引物及探针均有扩增及ct值符合标准的情况下为雄性胚胎，内标引物及探针扩增及ct值符合标准，而性别位点无扩增的情况下为雌性胚胎。一种牛及其早期胚胎性别鉴定的试剂盒，包含有上述pcr体系。上述pcr体系及试剂盒在牛及其早期胚胎性别鉴定中的应用。本发明利用牛折叠蛋白基因存在于牛x染色体上的特点，设计一组引物及探针，所述引物nb2-f、nb2-r和探针序列nb2-p，本组探针专用于鉴别是牛的胚胎，其他物种的鉴别不出来，然后再利用公牛的特异性基因sry,选取其序列进行引物及探针的特异性设计，引物bov97m-f、bov97m-r和探针bov97m-p,设计出的引物及探针只会扩出公牛的样本,将两组探针组合构建一个复合检测体系，成功鉴定牛早期胚胎的性别。该体系为双重探针一管式体系，内标探针和性别位点经验证物种特异性强。雄性胚胎检测结果不仅内标及性别位点出现扩增曲线，而且ct值也会在标准范围内，雌性胚胎性别位点不会有扩增信号和ct值，但是内标的ct值也会落在标准范围内，否则当不合格样本处理，这样就不存在判断错误的情况，检出率及准确率较高。检测过程更加简便，检测结果也更加灵敏、可靠。本发明进一步提供一种用于上述pcr扩增的优化pcr反应程序，该反应程序为：pcr反应条件为：95℃3min；然后95℃30s，58℃40s，循环45次；本发明同时通过改变传统pcr反应的扩增条件，而实现3小时之内完成样本处理加检测分析过程，耗时短。本发明所述的方法分别进行了适用机型及试剂类型的验证，目前q6、罗氏480、7900ht均适用，试剂方面kapa公司通用型探针mix,abi仪器配套试剂均可,减少了应用中对专有生产厂商的依赖性，大大降低了鉴定成本，此外，本检测体系及方法操作简单，方便，一般使用过荧光定量仪器并做过pcr扩增实验的人员均可操作。本发明方法成本低廉、操作简单、快速、准确、可靠、实用。当然，本领域技术人员很容易将本发明的引物及探针与相关的试剂制备成试剂盒，以方便使用。本发明的优势1.检测周期短，获得样本后3小时之内就可得到结果。我们采用了胚胎细胞免提取步骤，直接物理方法处理就可以进行扩增，扩增加检测时间共计1.5小时，能够在1天内出具报告，大大加快了速度。2.灵敏度高，每次检测只需皮克级别的dna，3-5个胚胎细胞就可以满足检测要求，样本需求量少。3.准确性高，采用内标探针及性别位点探针双重保证，经过长期的摸索，得到了一种稳定的复合体系，在确定含有牛的胚胎样本的同时鉴定胚胎的性别。同常规pcr和巢式pcr方法相比，本技术对人员操作要求较低，发生污染的几率更小，况且我们有荧光定量平台多年的实验操作经验，保证操作准确可靠。4.物种特异性好：经过物种特异性验证，许多物种样本均无扩增，只有在牛的样本中有扩增，由此可见，本体系的探针特异性强。附图说明图1nb2单扩验证，图2公牛血液和胚胎样本，母牛血液及胚胎样本性别位点扩增曲线图，图3公牛胚胎样本复合体系扩增结果，图4母牛胚胎样本复合体系扩增结果，图5不合格样本复合体系扩增结果(nb2ct＞30)图6不合格样本复合体系扩增结果(nb2&bov97mct值均未出)具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。(实施例3-5均是3-5个细胞，最低限是3-5个细胞。)实施例1根据牛折叠蛋白基因和sry基因设计的引物及探针序列如表1。表1内标及性别位点引物及探针序列标准pcr扩增反应体系：将384孔板置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性10秒，第3步58℃退火20秒，重复2至3步44次。图1为单nb2扩增，血液dna与胚胎样本结果ct值差别不大，均出现ct值；图2为公牛血液和胚胎样本，母牛血液及胚胎样本性别位点bov97m扩增曲线图；图3为公牛胚胎样本复合扩增；图4为母牛胚胎样本复合扩增体系，除了上述血液扩增效果好外，母牛无论血液还是胚胎样本，性别位点均不会有扩增；图5、图6为不合格样本的扩增。雄性胚胎检测结果不仅内标及性别位点出现扩增曲线，而且ct值也会在标准范围内，雌性胚胎性别位点不会有扩增信号和ct值，但是内标的ct值也会落在标准范围内，否则当不合格样本处理，这样就不存在判断错误的情况，检出率及准确率较高。实施例2特异性表2内标引物及探针与性别位点引物及探针物种特异性验证结果samplename驴狼牛貉子鸡羊老鼠狍子nb2ctundetermined38.2235317228.2631406836.72767639undetermined34.90315628undeterminedundeterminedbov97mctundeterminedundetermined34.5287456undeterminedundeterminedundeterminedundeterminedundeterminedsamplename水貂银狐蓝狐54-人源57-人源ntcntcntcnb2ctundetermined34.27249908undetermined36.5640869136.340740238.9643592839.4730186537.88671875bov97mctundeterminedundeterminedundeterminedundeterminedundeterminedundeterminedundeterminedundetermined经过物种特异性验证，许多物种样本均无扩增，只有在牛的样本中有扩增，由此可见，本体系的引物及探针特异性强。实施例3(已知性别样本检测验证)以下是采用本发明对客户提供78例牛胚胎样本进行检测及性别鉴定的验证1.dna处理采用物理高温方法对胚胎细胞进行处理，处理后的样本离心处理，即为模板，操作时将模板混匀。2.荧光定量pcr检测2.1反应体系：客户提供的样本分三次送样，第一次送样32例，全是公牛，其中有故意不取样的样本，第二次公牛和母牛均有共计26个，第三次公牛与母牛和空孔均有共20个，且本次客户用自己的方法进行了检测，每次性别均已知晓，本申请人就按照操作标准进行检测，体系如下：将各反应试剂振荡混合后按表2体积比(dna除外)配成pcr反应混合液，分装到20ul384孔反应管中，最后往各反应管加入7ul模板，封膜后离心然后上机检测。表3标准扩增反应体系2.2pcr反应程序：将384孔板置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性10秒，第3步58℃退火20秒，重复2至3步44次。2.3数据分析：检测结束数据用软件进行分析，检查阳性对照及阴性对照扩增曲线及ct值，确定扩增效果，阳性对照扩增结果较好，阴性对照无扩增，然后将内标及性别位点的扩增ct值导出。2.4性别判定标准2.5结果统计共计检测样本78例，其中公牛，母牛，不合格样本，与客户提供的性别结果完全一致。实施例4(大量样本批量检测)以下是申请人采用本发明对6547例牛胚胎样本进行大量检测的具体实施情况。1.dna处理采用物理高温方法对胚胎细胞进行处理，处理后的样本离心处理，即为模板，操作时将模板混匀。2.荧光定量pcr检测2.1反应体系：根据总样本数、设计批量方案，编写板标，分多个384孔板进行批量检测，体系配制如下,每次配制一板体系，检测分多次，一次大概检测192个样本，按照奇数行加样，以免太密集加串孔。将各反应试剂振荡混合后按表3体积比(dna除外)配成pcr反应混合液，分装20ul384孔反应管中，最后往各反应管加入7ul模板，封膜后离心然后上机检测。表3标准扩增反应体系2.2pcr反应程序：将384孔板置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性10秒，第3步58℃退火20秒，重复2至3步44次。2.3数据分析：检测结束数据用软件进行分析，检查阳性对照及阴性对照扩增曲线及ct值，确定扩增效果，阳性对照扩增结果较好，阴性对照无扩增，然后将内标及性别位点的扩增ct值导出。2.4性别判定标准2.5结果统计本次共计检测样本6547例，其中公牛3118例，母牛3106例，不合格样本323例，据客户反馈，符合以往公牛和母牛比例，同时又检测了1044例样本，结果复合客户要求。所以经过接近8000例样本的检测，结果复合客户要求，说明本体系已稳定，可以进行市场推广并大量接收样本等。序列表<110>北京阅微基因技术有限公司石家庄天泉良种奶牛有限公司<120>牛及其早期胚胎性别鉴定的体系、方法及试剂盒<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgggactggactgggat17<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctgactctacgactgtct18<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cctcgcatgcagct14<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaccagtggctagcagcatcaa22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaccagtggctagcagcatcaa22<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctgctcgatagcaacc16当前第1页12