与猪经产产仔数相关的SNP分子标记、鉴定及其应用的制作方法

本发明涉及猪育种领域，具体涉及用来提高猪繁殖效率的与猪经产产仔数相关的SNP分子标记及其鉴定。

背景技术：

繁殖性能是影响养猪业经济效益的关键因素之一。猪作为多年胎生动物，繁殖性状中的一个很重要的指标是产仔数，尤其是经产产仔数，产仔数高低可直接关系到育肥猪的数量多少和猪肉供给量的多少。

母猪的繁殖能力受多种因素影响，包括母猪品种、胎次、胎盘效率、激素水平、营养水平、配种工作等。其中，类固醇激素包括肾上腺皮质激素和性激素(雄性激素和雌性激素)，对调节母猪的繁殖能力及维持正常妊娠发挥着重要的功能。认知该类激素合成的作用及分子机制，特别是探索新的调控基因或酶在激素合成过程中的作用及对繁殖的影响，对于指导我们在繁殖生产过程中应用外源生殖激素、提高繁殖生产效率及高繁殖力母猪的选育具有非常重要的指导意义。同时，对猪经产产仔数相关基因的鉴定可为解释猪和其他哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。

寻找基因中的多肽位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段。目前进行相关SNP位点(单核苷酸多态性位点)筛选最为广泛使用的方法为全基因组关联分析(GWAS)。GWAS是利用全基因组范围内筛选出高密度的分子标记对所研究的群体进行扫描，分析扫描得出的分子标记数据与表型性状之间关联关系的方法。然而，运用GWAS的方法寻找与猪产仔性状相关的SNP位点，得到的结果庞杂无序，大多数的基因变异与目标性状并不相关。在此庞杂无序的结果中选择相关SNP位点是相当困难的。因而，有必要预先选择特定的基因，结合GWAS方法确定位于特定基因上的相关SNP位点。

目前获得高经产产仔数猪的方法主要集中在基因组编辑，通过对目标基因进行“编辑”，包括对特定DNA片段的敲除、特异突变引入和定点DNA片段转入等，从而实现对基因组的精确修饰。然而，人们在对猪肉产量要求提高的同时，越来越注重猪的培育方法对猪品质的作用，对人类健康的影响。由于科学界难以在短时间内证实转基因动物对人类的健康完全无副作用，以及广大群众对转基因动物的认知不足，人们对食用非转基因动物存在强烈的渴求。除去基因组编辑技术，其他育种理论的实现同样需要对猪基因组的了解。然而，目前对猪基因组的了解和认识远远不足，对影响猪繁殖效率的基因掌握尚不全面，有必要进一步进行研究，满足猪培育方法的需求。

因此，本发明的目的在于明确一个与猪经产产仔数相关的基因，提供与猪经产产仔数相关的SNP分子标记、该SNP分子标记的鉴定及其应用，通过对特定基因进行基因多态性与经产产仔数的关联分析，寻找与猪产仔性状相关的SNP分子标记；同时提供一种全新的高繁殖效率猪的培育方法，利用该SNP分子标记选育猪种，实现我国猪育种理论和技术水平的提升。

技术实现要素：

针对上述猪育种方法中存在的问题，本发明人进行了锐意研究，运用全基因组关联分析的方法对DHRS4基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析，并首次在该猪基因中找到了与经产产仔数相关的SNP分子标记，丰富了影响猪繁殖效率的SNP位点；同时还提供一种用以提高猪的繁殖效率(经产产仔数)的多组学整合精准育种方法，该方法不采用基因组编辑手段，提高了广大群众接受度，可综合多层次遗传变异效应，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)一种与猪经产产仔数相关的SNP位点，所述SNP位点位于猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594，NCBI参考SNP编号为rs701332503，该SNP位点的两种等位基因为C和T。

(2)根据上述(1)所述的SNP位点，所述SNP位点对应的三种基因型分别为CC、TT和TC基因型，基因型为CC的猪相较于基因型为TT和TC的猪有更高的经产产仔数。

(3)根据上述(1)所述的SNP位点，用以检测所述SNP位点基因分型的方法中涉及PCR扩增反应，PCR扩增反应中扩增引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

(4)根据上述(1)所述的SNP位点，用以检测所述SNP位点基因分型的方法中涉及单碱基延伸反应，单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(5)根据上述(1)所述的SNP位点，用以检测所述SNP位点的试剂盒包括一组扩增引物P1和P2，所述扩增引物P1和P2的核苷酸序列分别包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列；和/或

用以检测所述SNP位点的试剂盒包括延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示序列；和/或

用以检测所述SNP位点的试剂盒还包括PCR反应试剂、PCR产物纯化试剂。

(6)一种鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数的方法，所述方法包括检测猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处脱氧核糖核苷酸为C、或T、或C和T，以确定待测猪的基因型是CC、TT或TC的步骤，根据基因型确定猪经产产仔数：基因型为CC的猪相较于基因型为TT或TC的猪有更高的经产产仔数，

其中，CC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为C的纯合体；TT基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；TC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为T和C的杂合体。

(7)一种高经产产仔数猪的育种方法，所述方法包括选择参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC的猪作为亲本进行育种的步骤；

具体地，所述育种方法包括如下步骤：

步骤1，选择参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC的猪作为亲本配种，获得F1代仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行基因型分析，选育参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC的仔猪，成年后继续配种得F3代仔猪；

重复上述步骤2或3，最终得到基因型CC的高经产产仔数遗传性的种猪。

(8)根据上述(7)所述育种方法，所述育种方法还包括通过测定猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量，判定经产产仔数；

其中，猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量越低，猪有较高的经产产仔数，mRNA的表达量越高，猪有较低的经产产仔数。

(9)根据上述(7)所述育种方法，所述育种方法还包括通过测定猪卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量，判定经产产仔数；

其中，NRDR蛋白的表达量越低，猪有较高的经产产仔数，NRDR蛋白的表达量越高，猪有较低的经产产仔数。

(10)上述(1)所述的SNP位点在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途；

猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途；

猪卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途。

(11)上述(3)所述用以检测所述SNP位点的扩增引物，或上述(4)所述用以检测所述SNP位点的延伸引物在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途。

根据本发明提供的与猪经产产仔数相关的SNP分子标记、鉴定及其应用，具有以下有益效果：

本发明人在众多基因中选择特定的DHRS4基因进行猪繁殖性状关联性分析，首次发现该基因中特定SNP位点与经产产仔数存在相关性，可有效用于鉴定或辅助鉴定高经产产仔数猪，加快高产仔数猪的育种过程。

将DHRS4基因中SNP位点基因型分析、DHRS4基因表达量分析等多组学检测相结合，在不采用基因组编辑手段的前提下，通过人工选育获得高稳定性和高产率猪种，实现多组学整合精准育种理论的应用，显著提升我国猪育种理论水平和技术水平。

附图说明

图1示出DHRS4基因mRNA水平在大白猪及梅山猪卵巢中的表达差异；；

图2示出DHRS4基因蛋白水平在大白及梅山猪中卵巢中的表达差异；

图3示出DHRS4基因蛋白水平在大白及梅山猪中卵巢中的表达差异。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明中，选择大白猪进行经产仔性状相关的SNP位点的鉴定。大白猪在我国的猪种培育中占较高比重，选择上述猪种，便于后续对我国猪种的培育。

本发明运用全基因组关联分析(GWAS)的方法寻找与猪经产仔性状相关的SNP位点。GWAS方法寻找与猪经产产仔数相关的SNP位点存在的不足之处在于，容易得到庞杂无序的结果，且大多数的基因变异与目标性状并不相关；在此庞杂无序的结果中选择相关SNP位点存在较大困难。因而，有必要预先选择特定的基因，结合GWAS方法确定位于该特定基因上的相关SNP位点。

为此，本发明在众多待筛选的基因中选择特定的基因，进而确定该基因上的SNP位点，极大提高了对于相关SNP位点确定的成功率。其中，该特定的基因为DHRS4基因。

研究发现，由DHRS4基因编码的NRDR(抗辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶)除参与体内维甲酸合成外，对类固醇激素、维生素K3、靛红等物质也显示出不同的羰基还原酶的催化活性。高通量检测胚胎发育、肿瘤细胞与正常细胞基因差异表达的结果发现DHRS4基因在胚胎肢体发育过程中表达上调。就此，本发明人认为，DHRS4基因可能通过影响维甲酸等因子的合成，参与细胞内信号传导，并与胚胎细胞增殖分化的发生相关。

动物繁殖性状方面的研究表明，DHRS4基因在雄激素高的猪种睾丸中的表达高于雄激素低的猪种，但在这一发现之后并没有其他深入的研究结果。本发明人考虑到，DHRS4基因与类固醇激素的合成相关。然而具体DHRS4基因在调节类固醇激素合成方面的作用机制并不明确，仍需要进一步的研究。

现有的研究中，DHRS4基因研究主要集中于分析其在不同组织中的表达情况。该基因在猪中的研究较少，在繁殖相关通路中与上下游基因的关系，对于猪繁殖性能调控的分子机制等方面仍有待揭示。本发明人运用全基因组关联分析的方法对这个基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析，经过大量的研究，首次在该基因中确定了与产仔性状相关的SNP位点。

本发明人将GWAS方法与筛选的特定基因相结合，提供了一个DHRS4基因中与猪经产产仔数相关的SNP位点，所述SNP位点位于猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594，NCBI参考SNP编号为rs701332503，该SNP位点的两种等位基因为C和T。脱氧核糖核苷酸C的基因频率为0.432，脱氧核糖核苷酸T的基因频率为0.568。

该SNP位点对应的三种基因型分别为CC、TT和TC，CC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为C的纯合体；TT基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；TC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。

本发明人经过大量研究发现，基因型为CC的猪相较于基因型为TT和TC的猪有更高的经产产仔数。

本发明中基因分型利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术：首先PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息，该方法也称为Sequenom MassArray SNP基因型分析技术。

由上述知，SNP位点基因分型测定过程中，涉及猪基因组的DNA的提取，PCR扩增反应和单碱基延伸反应等步骤。

其中，所述PCR扩增反应中扩增引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

其中，所述单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

相应地，本发明提供了一种与猪经产产仔数相关的SNP位点基因分型的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取猪的基因组DNA；

(2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用扩增引物和延伸引物进行Sequenom MassArray检测，确定猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型。

其中，所述PCR扩增反应中扩增引物(P1和P2)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；延伸引物如SEQ ID NO.3所示。

本发明中与猪经产产仔数相关的SNP位点基因分型的检测方法，还包括直接测序法或者通过试剂盒测定。

所述试剂盒包括(1)PCR扩增引物P1和P2；优选还包括(2)PCR反应试剂：包括PCR缓冲液、dNTP、PfuDNA聚合酶，SNaPshot混合液；(3)SNP位点的PCR延伸引物；(4)PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶，以及纯化用缓冲液。

本发明中提供的检测试剂盒的使用方法为：从猪耳或其他组织细胞中提取DNA样品；配制PCR反应体系，进行PCR扩增、纯化PCR产物；PCR产物与SNP点的延伸引物同时进行延伸反应；对延伸产物进行毛细管电泳分析；SNP位点分析，进而还可得到基因分型信息。上述SNP位点分析可采用但不限于ABI3730XL自动测序仪。

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数的方法，包括检测猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处脱氧核糖核苷酸为C、或T、或C和T，以确定该基因位点的基因型是CC、TT或TC，根据基因型预测猪经产产仔数的高低：基因型为CC的猪相较于基因型为TT或TC的猪有更高的经产产仔数。

其中，CC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为C的纯合体；TT基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；TC基因型为猪该SNP位点的脱氧核糖核苷酸为T和C的杂合体。

本发明提供了一种高经产产仔数猪的育种方法，包括选择参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处基因型为CC的猪作为亲本进行育种的步骤。具体的：

步骤1，选择参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处基因型为CC的猪作为亲本(F0)配种，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处基因型为CC的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行基因型分析，选育参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处基因型为CC的仔猪，成年后继续配种得F3代仔猪。

重复上述步骤2或3，最终得到基因型CC的高经产产仔数遗传性的种猪。上述方法遵从自然繁殖，通过较少人工干预，获得高经产产仔数的种猪；同时，所述育种方法为非转基因方法，群众的接受度更高，可有效促进养猪业发展，提升我国猪种业的核心竞争力。

本发明还提供了一种上述SNP位点在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途。

本发明还提供了一种用以检测上述SNP位点的延伸引物或扩增引物在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途。

本发明还提供了一种用以检测上述SNP位点的基因分型方法在鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数方面的用途。

本发明人经过大量研究认为：经典遗传育种理论建立在“硬遗传”(孟德尔遗传)基础之上，其本质只考虑DNA序列变异体对形状遗传变异的影响。大规模GWAS分析结果表明，全基因组关联SNPs只能解释表型变异的一部分，表型变异尚有一部分不能由DNA水平的变异体所决定，即存在所谓的“缺失遗传力”(missing hertitability)现象。尽管有学者从统计角度对“缺失遗传力”问题进行了校正的尝试，但缺乏生物学上的合理解释。在传统观念中，除了RNA编辑、剪切，以及蛋白质分子修饰之外，遗传信息从DNA到表型的传递过程几乎是线性的，至于DNA以下的所有环节，包括中间分子信息和表型均最终受控于基因组DNA，生物的可遗传组分完全由基因组DNA的序列信息决定。因此，猪基因组选择和基因组编辑育种被认为是突破猪育种瓶颈的重要途径。

但随着研究的不断深入，这种传统观点正逐渐被打破。目前已经认识到，DNA水平变异对猪群体和个体表型差异的作用被高估，基因组表达调控机制不完全清楚，多层次组学对表型的效应被低估，猪种个性化遗传机制未受到关注。猪个体间巨大的表型遗传差异不仅取决其基因组结构和DNA顺序的变异，更主要取决于基因组多层次表达调控。为了实现基因组信息的高效应用，有必要开展猪多组学变异研究，整合多组学信息、建立种群个性化多组学整合精准育种理论和技术体系，实现多组学选择，这将显著提升我国猪育种理论和技术水平。

基于上述考量，本发明人在转录水平和蛋白表达水平上对影响猪生产效率的因素进行了分析和验证。

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数的方法，通过测定猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量，判定经产产仔数。

上述鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，包括获得猪卵巢组织细胞的总RNA，经反转录、定量PCR确定猪DHRS4基因mRNA的表达量，mRNA的表达量越低，猪有较高的经产产仔数，mRNA的表达量越高，猪有较低的经产产仔数。

其中，定量PCR扩增程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，5s；延伸60℃，30s；重复40个循环；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s。

其中，用于测定DHRS4基因mRNA的表达量的PCR扩增引物P3和P4，P3和P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种用于测定DHRS4基因mRNA的表达量的试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物P3和P4，P3和P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

进一步的，本发明还提供了一种高经产产仔数的猪的育种方法，包括选择猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量低的母猪作为亲本进行育种的步骤。具体的：

步骤1，选择卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量低的母猪作为亲本(F0)配种，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行mRNA定量分析，选育卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量低的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行mRNA定量分析，选育卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量低的仔猪，成年后继续配种得F3代仔猪。

重复上述步骤2或3，最终得到卵巢组织中低表达量DHRS4、高遗传性的种猪。

本发明根据上述与猪产仔性状相关的DHRS4基因、扩增引物、表达量测试方法、表达量检测试剂盒，还可提供基于上述公开在鉴定和/或选育种猪方面的应用，所述种猪具有较高的经产产仔数。

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数的方法，通过测定猪卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量，判定经产产仔数。

上述鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，包括获得猪卵巢组织细胞的总蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体孵育、显色，确定猪卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量，NRDR蛋白的表达量越低，猪有较高的经产产仔数，NRDR蛋白的表达量越高，猪有较低的经产产仔数。

进一步的，本发明还提供了一种高经产产仔数的猪的育种方法，包括选择卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量低的母猪作为亲本进行育种的步骤。具体的：

步骤1，选择卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量低的母猪作为亲本(F0)配种，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行DHRS4基因编码的NRDR蛋白的定量分析，选育卵巢组织中NRDR蛋白的表达量低的仔猪，成年后继续配种得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行DHRS4基因编码的NRDR蛋白的定量分析，选育卵巢组织中NRDR蛋白的表达量低的仔猪，成年后继续配种得F3代仔猪。

重复上述步骤2或3，最终得到卵巢组织中低表达量NRDR蛋白、高遗传性的种猪。

本发明中，具体地，多组学整合精准育种方法包括以下步骤：

步骤1，选择符合至少以下两个条件的母猪作为亲本(F0)配种，获得第一代(F1代)仔猪：(i)卵巢组织中DHRS4基因mRNA低表达量、(ii)卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白低表达量、(iii)参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC；

步骤2，选育F1代符合至少以下两个条件的仔猪进行配种，获得第二代(F2代)仔猪：(i)卵巢组织中DHRS4基因mRNA低表达量、(ii)卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白低表达量、(iii)参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC；

步骤3，选育F2代符合至少以下两个条件的仔猪进行配种，获得第三代(F3代)仔猪：(i)卵巢组织中DHRS4基因mRNA低表达量、(ii)卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白低表达量、(iii)参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC；

重复上述步骤2或3，最终得到卵巢组织中DHRS4基因mRNA低表达量、卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白低表达量、且参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处的基因型为CC的高经产产仔数的种猪。

上述方法遵从自然繁殖，通过较少人工干预，获得高经产产仔数的种猪；同时，所述育种方法为非转基因方法，群众的接受度更高，可有效促进养猪业发展，提升我国猪种业的核心竞争力。

本发明中，还提供了一种基于多组学整合精准育种的鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数的方法，至少包括以下两步骤：

步骤(1)，测定猪卵巢组织中DHRS4基因mRNA的表达量，mRNA表达量低的猪，具有较高的经产产仔数；

步骤(2)，检测猪卵巢组织中DHRS4基因编码的NRDR蛋白的表达量，NRDR蛋白表达量低的猪，具有较高的经产产仔数；

步骤(3)，检测猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594处脱氧核糖核苷酸为C、或T、或C和T，以确定待测猪该SNP位点处的基因型是CC、TT或TC，或者直接通过Sequenom MassArray等方法确定基因型，根据基因型确定猪经产产仔数：基因型为CC的猪相较于基因型为TT或TC的猪有更高的经产产仔数。

综合上述基因层面、转录层面和蛋白表达层面的分析，利用多组学技术手段进行分析，整合多组学信息，系统阐述遗传变异对选择和驯化的效应，实现了目标群体的多维组学选择，提高了猪育种的准确性，可精准获得高稳定性和高选择性的种猪。

实施例

实施例1SNP分子标记的获得

1、实验样品采集

来自山东某种猪场的234头大白猪，用于DHRS4基因SNP分型。逐个采集耳组织样，放于75％的酒精中并-20℃保存，待提DNA。

2、DHRS4基因SNP分型

2.1猪基因组DNA的提取与检测

(1)剪取适量的猪耳组织，剪碎将其放进1.5mL的Axgen管中；

(2)取50mLBD离心管，将终浓度为0.4mg/mL的蛋白酶K和裂解缓冲液进行混合均匀，向装有猪耳朵组织的1.5mL的离心管中加入0.5mL裂解液进行裂解；

(3)离心管平行均匀的放置于恒温杂交炉的摇板上(严封管盖，以免液体外渗)。55℃放置6小时以上(消化过程中样品的充分混合是非常重要的，判断依据是无明显肉眼可见的猪耳组织，消化后的混合液成乳状)；

(4)待样品充分裂解后，取出离心管，在每管中加入0.3mL饱和氯化钠溶液，进行颠倒充分混合6-8次，然后放于冰上，冰浴15分钟；

(5)冰浴过后，12000rpm室温离心15分钟，小心缓慢的将上清转移至新的1.5mL Axgen离心管中(小心避免沉淀随上清一起倒出，保持倒的手法要一致，保持每管倒得上清在量上保持相同)；

(6)加入0.7mL的异丙醇(加入异丙醇的量随倒出的上清的量的变化而变化，二者等体积)于各管，颠倒直至溶液中有絮状沉淀出现(若无絮状沉淀，可将溶液-20℃冰箱放置2小时或4℃冰箱放置过夜)；

(7)12000rpm室温离心15分钟，去掉上清液体(此过程中留意观察离心管底部的白色DNA沉淀，切勿将其与上清一起倒掉)；

(8)在各离心管中加入0.5mL 70％乙醇，轻轻颠倒以充分冲洗上述沉淀出来的DNA；

(9)10000rmp离心30s，用200μL微量移液枪将离心管中的乙醇吸掉，将沉淀的DNA留在管中(当心勿将管中的DNA沉淀吸走，此步骤所用的枪头在各离心管间操作时可不用更换)；

(10)自然风干DNA10分钟；

(11)移液枪取0.1mL的TE缓冲液于各管中，将上述DNA沉淀重新溶解，置其于55℃放置2小时，定时摇晃数次，以使DNA充分溶解；

(12)待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度(基因分型需要标化样本DNA浓度和OD值，DNA浓度15-20ng/μL，体积为30μL，A260/230介于1.5～2.3)，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量(可见单一条带)；

(13)将DNA溶液放置4℃过夜，次日取1μL进行PCR(若数星期内使用所提DNA，可在4℃保存；如若长时间不使用，需放置于-20℃环境下)。

2.2SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将234个大白猪的DNA样品，SNP的相关信息交给北京康普森生物有限公司进行Sequenom MassArray核酸质谱测序。

以样本DNA为模板，加入PCR扩增引物(P1和P2)对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增反应，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点。

2.3数据整理与分析

1)表型数据分析

利用SAS9.2统计分析软件，对猪初产产仔性状以及经产(2-8次)产仔性状测定值进行描述性统计分析，包括计算性状的平均值、标准差、最大值和最小值。

2)单倍型分析

单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的。利用SAS9.2软件中的GLM过程分析SNP和产仔数等性状的关联分析，固定效应模型如下：

y＝μ+gi+mk+e

y为繁殖性状的表型记录；μ为性状的总平均值；gi为基因型效应；mk为生产月份效应；e为随机误差。数据以概率值和平均值±标准差表示，**(P值＜0.05)表示差异有统计意义，***(P值＜0.001)表示差异有高度统计意义。

2.4结果分析

通过上述Sequenom MassArray，测得大白猪DHRS4基因SNP分型结果，如表1所示。

表1

研究发现了DHRS4基因中存在与母猪的繁殖性状显著相关的SNP位点rs701332503，位于猪参考基因组Sscrofa11.1的Chr7:75245594。对rs701332503基因型检测结果表明：37头猪的基因型为CC基因型，69头猪的基因型为TT基因型，128头猪的基因型为TC基因型。猪DHRS4基因在检测猪群中的基因型频率结果：CC基因型频率为0.158，TT基因型频率为0.295，TC基因型频率为0.547，TC的基因型频率高于CC和TT，TC等位基因为优势基因。

利用SAS9.2软件对基因型和母猪繁殖性状进行统计分析，并做样本间多重比较。结果如表2所示。

表2

从表2可以看出，rs701332503位点不同基因型间经产产仔数差异极显著。初产数据中，TT型和CT型的产仔数、窝重和平均胎重均略高于CC型，但是不存在统计意义；经产数据中，TT型和CT型的平均胎重略高于CC型，但是不存在统计意义；CC型的经产产仔数和窝重高于TT型和CT型，且经产产仔数差异有高度统计意义。

因此，SNP位点(rs701332503)明显对猪的经产产仔数有影响，在实际的猪育种中，CC基因型的猪具有更高的繁殖效率。

综上所述，可以通过确定猪DHRS4基因的SNP位点(rs701332503)的核苷酸来确定猪个体为CC基因型还是TT和CT基因型，从而辅助鉴定经产产仔数：CC基因型的猪具有更高的繁殖效率。

CC基因型为猪rs701332503位点的脱氧核糖核苷酸为C的纯合体。

CT基因型为猪rs701332503位点的脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体；

TT基因型为猪rs701332503位点的脱氧核糖核苷酸为T的纯合体。

实施例2DHRS4基因表达量检测

1、实验样品采集

用于检测DHRS4基因表达的大白猪和梅山猪，来源于天津市武清区中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪场。采集出生后180天及300天母猪的卵巢，样品均储存在液氮中，提取总RNA。每个品种均采集三头个体作为生物学重复。其中，梅山猪是我国猪种中繁殖力最强、产仔数最多的品种之一，比大白猪等现代欧洲猪种同窝产仔数高30％～40％。将梅山猪与大白猪DHRS4基因表达量进行比较，可有效证明DHRS4基因表达量对经产产仔数的影响。

2、DHRS4基因表达量检测

2.1卵巢组织总RNA提取

RNA提取过程中所用玻璃器皿及镊子需经过200℃干烤4h以灭活RNase，Eppendorf管及移液器枪头均需使用RNase灭活产品，整个实验过程中实验人员需佩戴口罩及乳胶手套。

(1)样品采集：将收集的卵巢组织置于1.5mL的Eppendorf离心管中，按照RNA提取说明书进行操作；

(2)用研磨杵冰上研磨组织，加入1mL Trizol裂解液,剧烈震荡30s，室温静置10min，充分裂解组织细胞；

(3)加入0.2mL氯仿(氯仿:Trizol体积比为1:5)，剧烈振荡15s，室温静置10min，在4℃的情况下，12000g离心15min，重复该步骤直至抽提完全；

(4)吸取上层水相(约450μL)到新的Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀然后室冰上静止20min，在4℃的情况下，12000g离心10min；

(5)离心后观察到离心管底有少量白色胶状沉淀，弃上清，然后加入1mL 75％乙醇(用DEPC水配置)洗涤沉淀，在4℃的情况下，12000g离心10min，弃去乙醇，于超净工作台风干5-10min至沉淀呈半透明状；

(6)加入DEPC水溶解RNA沉淀，视沉淀量多少决定加入DEPC水量；

(7)紫外分光光度计测定样品RNA浓度。

2.2总RNA质量检测方法

取所提的样本RNA 1μL，利用Agilent 2100Bioanalyzer和琼脂糖凝胶电泳的方法检测RNA的质量。取RIN值(RNA integrity number，RNA分子完整数)大于8的样品为建库样品。同时采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，选取完整性高的样品进行后续mRNA定量。

2.3mRNA的反转录

用紫外分光光度计测定RNA浓度后，取2μg RNA加入2μL Oligo(dT)，用DEPC水补足体积至13μL，混匀后72℃水浴5min，然后冰上放置3-5min，离心后加入如下物质，混匀后，42℃水浴60min，-20℃保存。

表3反转录反应体系

2.4定量PCR

Real-time quantitative PCR反应按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq(TaKaRa,DRR041S)试剂盒说明书进行。每个样品设三个重复，反应在ABI Prism 7500实时荧光定量PCR系统中进行，β-actin为内参。PCR反应体系见表4，反应条件见表5，引物序列见表6。

表4 RT-qPCR反应体系

表5 RT-qPCR扩增程序

表6 mRNA qPCR引物

2.5结果分析

DHRS4基因表达量对经产产仔数影响的检测结果见图1。图1具体为DHRS4基因mRNA水平在大白猪及梅山猪卵巢中的表达差异。

由图1可知，高产仔数的梅山猪中DHRS4mRNA的表达量显著低于大白猪，意味着可以通过检测卵巢组织中DHRS4基因mRNA表达，鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数。

实施例3DHRS4基因相关蛋白表达水平指标的检测

1、组织样品处理和总蛋白定量

组织样品处理：将卵巢组织从液氮中取出,加入100μL RIPA裂解液,临用前加入DTT和PMSF终浓度1mM。用研磨杵研磨组织,置液氮中反复冻融几次,充分裂解细胞；冰上放置30min,然后12000g,在4℃的情况下离心30min,收集上清；

总蛋白定量：按BCA蛋白定量试剂盒说明书操作，标准品制备如表7，样品10倍稀释后加入10μL。在酶标仪570nm下读取数值。以A570为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，蛋白样品浓度从标准曲线中求出，乘以稀释倍数从而计算出样品原液浓度，吸取合适质量的样品加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5min使蛋白变性。分装冻存。

表7蛋白标准品的制备

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

将用来配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板清洗干净，烘干后，固定在架子上，首先按照表8(一块1mm厚度的聚丙烯酰胺凝胶所需的体积)配制分离胶，室温静止待分离胶凝结后约30分钟，再按照表8配制浓缩胶，然后插入泳道分离梳子室温静置待其凝结约40分钟。

表8分离胶和浓缩胶配制组分

按50μg总蛋白/泳道上样，80V电泳20min后，160V继续电泳约45min。

3、转膜

3.1电泳结束后按照预染蛋白分子标准品裁切目的蛋白所处凝胶，然后将凝胶浸泡在转膜缓冲液中；

3.2取出转膜电泳槽，先小心放一搅拌子在底部，再倒一半转膜缓冲液；

3.3剪取PVDF膜,略大于凝胶，先在培养皿中以少许甲醇浸湿数秒钟，再置入转膜缓冲液中浸泡10min后取出使用。另取两张滤纸，以及两片方形海绵垫，都放入转膜缓冲液中浸泡备用；

3.4取出转膜夹并打开平放，先垫一张方形海棉垫于红色面,铺上一张湿滤纸，小心放上已润湿的转印纸，其间勿陷入气泡；转印纸再滴上数滴缓冲液后，在其上小心平铺胶片，然后加盖一层滤纸及另一张海绵，也都不可陷入气泡，最后即可把整个转膜卡夹装好；

3.5将转膜夹置入已经放有一半转印缓冲液的转印槽中，注意有PVDF膜的那一面向正极(红色)，胶片那面向负极(黑色)；

3.6当转膜夹放入转膜槽后，放置冰盒，盖上盖子，倒入转膜缓冲液，然后放到一搅拌器上，打开搅拌器开始搅拌，同时接好电源，100V电压下，恒压湿转60min，将蛋白转膜到PVDF膜上；

3.7电转后的膜进行丽春红染色，此时可以看到清晰的蛋白条带，按预染蛋白分子标准所示范围精细裁剪PVDF膜，最后洗掉丽春红。

4、抗体孵育，显色及数据分析(以MAP3K8及GAPDH为例)

4.1电转后的PVDF膜,用5％脱脂奶粉或BSA(溶于0.05M pH 7.4的Tris buffer saline，TBS)的封闭液室温孵育3h；

4.2加1:2000稀释的NRDR抗体于4℃孵育48h；

4.3TBST(TBS内加入0.1％tween)洗涤，洗3次每次10min；加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(GAR-HRP,1:10000)，室温孵育2h；TBST洗涤，洗3次每次10min；

4.4ECL法显色：使用Millpore公司试剂盒，按照说明书所述操作。将1:1比例的底物和酶混合，室温放置约10min待恢复至室温。将膜蛋白面向上放置在干净的器皿内，然后将发光反应液滴加到其上，1-2min后，将膜放入自封带中，压片曝光；然后进行显影、定影；

4.5PVDF蛋白膜用抗体洗脱液在室温振荡洗涤10min，以洗掉结合的抗体。TBST洗3次每次10min洗去洗脱液；

4.6加入1:10000稀释的β-actin鼠源单克隆抗体，4℃孵育过夜；

4.7TBST洗3次每次10min。加1:20000稀释的二抗GAR-HRP，室温孵育3h；

4.8洗涤同上、ECL显色同上；

4.9光密度分析：免疫标记条带的光密度值即IDV(integrated density value)用ImageJ软件分析。GAPDH作为内参照。目标蛋白和内参照光密度的比值反应目标蛋白质的表达水平。

卵巢组织中DHRS4基因表达量对经产产仔数影响的检测结果见图2和图3。图2和图3具体为DHRS4基因蛋白NRDR水平在大白猪及梅山猪卵巢中的表达差异。

由图2和图3可知，高产仔数的梅山猪的卵巢组织中DHRS4蛋白NRDR的表达量显著低于大白猪，意味着可以通过检测DHRS4蛋白NRDR的表达，鉴定或辅助鉴定猪经产产仔数。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 佛山科学技术学院

<120> 与猪经产产仔数相关的SNP分子标记、鉴定及其应用

<130> 2018

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P1(Sus scrofa )

<400> 1

gccaggcagt tcaccctaat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P2(Sus scrofa )

<400> 2

aagtgctgga acaaccccaa 20

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 延伸引物(Sus scrofa )

<400> 3

acgttggatg tgtacttttt ccagaggcgg 30

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P3(Sus scrofa )

<400> 4

gccgtcaacc cattctttgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增引物P4(Sus scrofa )

<400> 5

gcaccactgc ctttgtcatc 20