一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用的制作方法

本发明属于生物领域，具体涉及一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmscs)已成为21世纪生命科学研究的重点，它是一类由friedenstein等最先发现的成纤维样细胞，能够自我增殖和多向分化。bmscs是一个有广阔前景的研究领域，有望被用在细胞疗法治疗中，这些都归功于其特殊能力，包括自身增殖能力强、分化范围广，能够修复损伤的功能组织及免疫调节等功能，不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。此外，因为它们具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，bmscs已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破。

因为bmscs在基础研究及临床应用方面均具有巨大潜能，所以对于其培养增殖仍然需要更进一步研究，以便可以更为高效地获取利用这种细胞。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

本发明通过如下技术方案实现：

技术方案一：

一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：

步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备

六棱菊种子经碱性蛋白酶alcalase2.4l+胰蛋白酶在复合配比3:1、ph为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/l、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。

步骤2、大孔树脂初步分离纯化

采用da201-c型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：

(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/ml的多肽冻干粉水溶液以0.5bv/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值a220，以a220＝0.05为穿透点；

(2)上样结束后，用去离子水以1bv/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4bv，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得f30粗品。

步骤3、凝胶过滤色谱纯化

将f30粗品配成浓度为50mg/ml的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的sephadexg-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1ml，洗脱液为去离子水，流速为15ml/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽f30。

优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。

优选地，碱性蛋白酶alcalase2.4l酶活力为2.4au/g。

优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500u/g。

优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。

优选地，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。

上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

技术方案二：

一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：

步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备

六棱菊种子经碱性蛋白酶alcalase2.4l+胰蛋白酶在复合配比3:1、ph为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/l、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。

步骤2、大孔树脂初步分离纯化

采用da201-c型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：

(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/ml的多肽冻干粉水溶液以0.5bv/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值a220，以a220＝0.05为穿透点；

(2)上样结束后，用去离子水以1bv/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4bv，收集60％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得f60粗品。

步骤3、凝胶过滤色谱纯化

将f60粗品配成浓度为50mg/ml的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的sephadexg-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1ml，洗脱液为去离子水，流速为15ml/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽f60。

优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。

优选地，碱性蛋白酶alcalase2.4l酶活力为2.4au/g。

优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500u/g。

优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。

优选地，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。

上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

技术方案三：

一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：

步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备

六棱菊种子经碱性蛋白酶alcalase2.4l+胰蛋白酶在复合配比3:1、ph为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/l、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。

步骤2、大孔树脂初步分离纯化

采用da201-c型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：

(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/ml的多肽冻干粉水溶液以0.5bv/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值a220，以a220＝0.05为穿透点；

(2)上样结束后，用去离子水以1bv/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％、75％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4bv，收集75％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得f75粗品。

步骤3、凝胶过滤色谱纯化

将f75粗品配成浓度为50mg/ml的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的sephadexg-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1ml，洗脱液为去离子水，流速为15ml/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽f75。

优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。

优选地，碱性蛋白酶alcalase2.4l酶活力为2.4au/g。

优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500u/g。

优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。

优选地，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。

上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

有益效果：

本发明提供的多肽可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖率，可以用于骨髓间充质干细胞的体外快速扩增，丰富骨髓间充质干细胞的细胞源。

附图说明

图1为f30粗品的sephadexg-15凝胶滤过色谱图；

图2为f45粗品的sephadexg-15凝胶滤过色谱图；

图3为f60粗品的sephadexg-15凝胶滤过色谱图；

图4为f75粗品的sephadexg-15凝胶滤过色谱图；

图5为多肽f30、f45、f60、f75对骨髓间充质干细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验方法

1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备

六棱菊种子(六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉)经诺维信碱性蛋白酶alcalase2.4l(2.4au/g)+胰蛋白酶(2500u/g)在复合配比3:1、ph为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/l、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。

2、大孔树脂初步分离纯化

采用da201-c型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：

(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/ml的多肽冻干粉水溶液以0.5bv/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值a220，以a220＝0.05为穿透点；

(2)上样结束后，用去离子水以1bv/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％、75％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4bv，收集各梯度洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得f30、f45、f60、f75粗品。

3、凝胶过滤色谱纯化

将f30、f45、f60、f75粗品配成浓度为50mg/ml的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的sephadexg-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1ml，洗脱液为去离子水，流速为15ml/h，检测波长220nm，根据色谱图收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽f30、f45、f60、f75。

4、对骨髓间充质干细胞的增殖促进作用

sd大鼠骨髓间充质干细胞的分离：采用全骨髓法(直接培养法)分离培养。①取体质量为100g左右的雄性sd大鼠，颈椎脱臼处死，用体积分数为75％乙醇浸泡3-5min(头部朝下，使乙醇没过于全身)。②移置细胞培养用超净台内，剪开大鼠腿部皮肤，分离腿部肌肉，取出大鼠股骨、胫骨。③用无菌纱块剔除大鼠股骨、胫骨部附着的肌肉组织，置入25cm²培养皿中备用。④用注射器吸取含有体积分数为12％胎牛血清的l-dmem10ml，备用。⑤用剪刀去除大鼠股骨、胫骨一端的软骨帽，将含有10ml培养基的注射器插入骨髓腔内缓慢冲洗四五遍，直至股骨、胫骨变成白色，尽量冲出骨骺中的细胞。⑥将冲洗好的细胞移入15ml离心管中，进行1000r/min离心，5min后去除上清液，再重新加入8ml完全培养基，用巴氏吸管吹打均匀后分别种入25cm²的培养瓶里，并放入37℃，体积分数为5％co2培养箱中进行培养。⑦原代培养48h，待细胞贴壁生长后进行第1次换液，两三天后细胞增殖达到80％-90％融合，第1代细胞以1:1传代，并加入碱性成纤维细胞生长因子(培养瓶中培养基量的1/200)，第1代以后传代则以1:2传代。骨髓间充质干细胞生长因子的制备：在10ml的pbs中加入10μg的碱性成纤维细胞生长因子和10mg的牛血清白蛋白配置成骨髓间充质干细胞生长因子溶液，用1ml的离心管分装，-20℃保存备用。

多肽f30、f45、f60、f75对骨髓间充质干细胞增殖活力的影响：将第3代对数期骨髓间充质干细胞的细胞数调整至2×10⁶个/ml，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μl，设实验组和对照组，实验组分为4组，分别加入多肽f30、f45、f60、f75终浓度为10μg/ml的l-dmem培养基各50μl，对照组使用不含多肽的培养基培养，另设置只含有培养基的空白组，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μlcck-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测od450值a(吸光度的大小与活细胞的数量呈正比)。根据所测od值计算细胞增殖率，细胞增殖率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)×100％。以对照组增殖率为100％。

二、实验结果

1、凝胶过滤色谱纯化结果

对f30、f45、f60、f75粗品配成浓度为50mg/ml的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的sephadexg-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1ml，洗脱液为去离子水，流速为15ml/h，检测波长220nm，根据色谱图1～4收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽f30、f45、f60、f75。

2、对骨髓间充质干细胞的增殖促进作用

结果如表1和图5所示。与对照组相比，多肽f30、f60、f75组骨髓间充质干细胞增殖率显著较高(p＜0.05)，多肽f45组骨髓间充质干细胞增殖率与对照组差异不明显(p＞0.05)。

表1多肽f30、f45、f60、f75对骨髓间充质干细胞增殖的影响

本发明提供的多肽可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖率，可以用于骨髓间充质干细胞的体外快速扩增，丰富骨髓间充质干细胞的细胞源。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。