一种使肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法与流程

本发明涉及一种使肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法,用于配制高稳定性的体外诊断试剂。

背景技术：

体外诊断，即invitrodiagnosis(ivd)，是指在人体外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息。目前，体外诊断试剂是医生诊治中不可缺少的手段，在对病人的诊断、治疗、疗效监测、预防及预后判断等方面，发挥着重要的作用。

使用酶法的生化试剂是体外诊断试剂中的主要一大类，具有操作简单、方便快捷、成本低廉等优点。这类体外诊断试剂通常制备成双液体试剂试剂盒，其检测过程可在各种型号的全自动生化仪上连续批量进行，故而在临床诊断上应用得极为广泛。

酶是生化诊断试剂中的核心物质，绝大多数酶是具有催化活性和高度选择性的蛋白质。然而，通常在这类生化诊断试剂中，酶是以溶质的形式存在于液态的试剂中的，在实践中发现，保存在溶液中的酶蛋白有时稳定性较差。即便对试剂的运输和贮存环境严格控制，试剂中酶的活性也会随着试剂保存时间的延长而可能下将，对使用时试剂的准确度可能造成影响。所以，酶在液体中的稳定性直接关系到生化诊断试剂的质量，进而可能影响医生对病人的诊断和治疗方案。

在诊断试剂的研发中我们发现了一种使酶在溶液中长期保持活性的方法，此方法对肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶有效，对配制长有效期的测定肌醇、糖化白蛋白和小而密低密度脂蛋白胆固醇的酶法生化试剂盒有用。

肌醇属于b族维生素的一种。研究表明，糖尿病患者的尿液中存在高浓度的肌醇排泄，通过测定糖负荷后人体尿液中的肌醇含量，可在无创的条件下检测出糖耐量的异常，用于明确空腹血糖无法反映的糖负荷后的高血糖状态(albertloyetal.diabetes,1990,39,1305)。因此在临床上，精确测定患者尿液中的肌醇含量对糖尿病的诊断具有重要的意义。

糖化白蛋白是血液中白蛋白和葡萄糖结合而成的。研究表明，糖化白蛋白值和人体血液中白蛋白与葡萄糖接触的量及时间成正比，可以迅速而明确地反映过去2-4周的血糖控制情况(jamesdayetal.diabetes,1980,29,524)。临床上糖化白蛋白可与糖化血红蛋白互为补充，对及时诊断爆发性糖尿病、及时调整糖尿病患者的用药量、准确掌握血糖不稳定的糖尿病患者的血糖情况等，有重要的临床价值。

小而密低密度脂蛋白是低密度脂蛋白中颗粒较小密度较大的亚组份。近来研究发现，小而密低密度脂蛋白更易于被氧化，血浆半衰期更长、更易进入动脉管壁，促进泡沫细胞的形成，小而密低密度脂蛋白与普通低密度脂蛋白相比，其致动脉粥样硬化能力更强(masumiaietal.clinicalchemistry,2010,56,967)。临床上，血液中小而密低密度脂蛋白胆固醇含量升高可增加冠心病患者发生心肌梗死的概率，是评价动脉硬化性心血管疾病危险性的可靠指标。

技术实现要素：

综上所述，本发明提供一种使肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法，用于配制测定肌醇、糖化白蛋白和小而密低密度脂蛋白胆固醇的酶法生化试剂盒，以达到使上述酶法生化试剂盒具有12个月以上有效期的目的。其特征在于，在保存酶的试剂溶液中添加4-甲酰基苯硼酸和苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚的组合物，虽然机理不明，但能达到长期保持溶液中肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶活性的目的，其中包括：

[1]一种使肌醇脱氢酶、酮胺氧化酶和鞘磷脂酶在液体中长期稳定的方法，其特征在于，在含有上述含有酶的液体试剂中添加4-甲酰基苯硼酸和苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚的组合物，使酶在液体中的长期稳定性大幅提高；

[2][1]中所述的含有酶的液体试剂中的4-甲酰基苯硼酸和苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚的浓度范围分别为0.008~0.012w/v%和0.1~0.2w/v%；

[3][1]中所述的含有酶的液体试剂是为以水为溶剂的缓冲液，包括但不限于3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸（capso）、磷酸盐（pbs）、三羟甲基氨基甲烷（tris）等缓冲液。

附图说明

图1.肌醇脱氢酶的长期稳定性测试。

图2.酮胺氧化酶的长期稳定性测试。

图3.鞘磷脂酶的长期稳定性测试。

具体实施方式

本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明,实施案例中所使用的试剂如表一所示.

表一：实施例中试剂来源

实施例1：肌醇脱氢酶的长期稳定性测试

按以下步骤制备含有肌醇脱氢酶及稳定剂的液体试剂a：

[1]称取23.73g的3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]在[1]中溶液中依次加入苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚1.5g、4-甲酰基苯硼酸0.1g，并用0.1mhcl调节ph至9.0，最终定容为1l；

[3]将肌醇脱氢酶1000mg加入[2]中溶液，最终配置成肌醇脱氢酶液体试剂。

按以下步骤制备含有肌醇脱氢酶，不含有稳定剂的对照液体试剂b：

[1]称取23.73g的3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]在[1]中溶液用0.1mhcl调节ph至9.0再加入肌醇脱氢酶1000mg，最终定容为1l，最终配置成含肌醇脱氢酶的对照液体试剂b。

将含有稳定剂的液体试剂a和不含稳定剂的对照试剂b同时保存在4℃的冰箱中，每隔30天取出按以下步骤测试其中肌醇脱氢酶的活性：

[1]用200mm甘氨酸-盐酸缓冲液配制含有100mmm-肌醇和30mmnad⁺的反应试剂，并将ph调至9.6；

[2]取2个石英比色皿，分别加入3ml上述反应试剂并在37℃孵育5min；

[3]分别取50ul液体试剂a和对照液体试剂b分别加入上述2个石英比色皿中，并用紫外可见分光光度计分别测量其在340nm的吸光度；

[4]使用下列公式计算肌醇脱氢酶的活力：

式中，△a=asample-ablank；m(nadh)为nadh在340nm的摩尔吸光系数,其值为6.22；vt为总反应体积；vs为样品体积；x为样品中酶浓度。

其结果如图1所示，可以看出使用本发明方法保存肌醇脱氢酶的酶活力在12月内并没有明显降低，而未使用本发明方法保存的肌醇脱氢酶的酶活力大幅下降。

实施例2：酮胺氧化酶的长期稳定性测试

按以下步骤制备含有酮胺氧化酶及稳定剂的液体试剂c：

[1]称取13.6g的磷酸二氢钾和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]在[1]中溶液中依次加入苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚1.5g、4-甲酰基苯硼酸0.1g，并用1m氢氧化钠调节ph至7.5，最终定容为1l；

[3]将酮胺氧化酶1000mg加入[2]中溶液，最终配置成肌醇脱氢酶液体试剂。

按以下步骤制备含有酮胺氧化酶，不含有稳定剂的对照液体试剂d：

[1]称取13.6g的磷酸二氢钾和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]将溶液[1]用0.1m氢氧化钠调节ph至7.5，并加入酮胺氧化酶1000mg，最终定容为1l，最终配置成含酮胺氧化酶的对照液体试剂b。

将含有稳定剂的液体试剂c和不含稳定剂的对照试剂d同时保存在4℃的冰箱中，每隔30天取出按以下步骤测试其中肌醇脱氢酶的活性：

[1]用100mmpbs缓冲液配制含有0.02%n,n-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(todb)、1.5mm4-安替吡啉、5u/ml辣根过氧化酶和0.1mm4-羟基苯乙胺的反应试剂，并将ph调至7.5；

[2]取2个石英比色皿，分别加入3ml上述反应试剂并在37℃孵育5min；

[3]分别取50ul液体试剂c和对照液体试剂d分别加入上述2个石英比色皿中，并用紫外可见分光光度计分别测量其在546nm的吸光度；

[4]使用下列公式计算酮胺氧化酶的活力：

式中，△a=asample-ablank；m(todb)为todb在546nm的摩尔吸光系数,其值为16.0；vt为总反应体积；vs为样品体积；x为样品中酶浓度。

其结果如图2所示，可以看出使用本发明方法保存酮胺氧化酶的酶活力在12月内并没有明显降低，而未使用本发明方法保存的酮胺氧化酶的酶活力大幅下降。

实施例3：鞘磷脂酶的长期稳定性测试

按以下步骤制备含有鞘磷脂酶及稳定剂的液体试剂c：

[1]称取15.7g的三（羟甲基）氨基甲烷和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]在[1]中溶液中依次加入苄基二甲基酚基聚氧乙烯醚1.5g、4-甲酰基苯硼酸0.1g，并用1mhcl调节ph至8.0，最终定容为1l；

[3]将鞘磷脂酶1000mg加入[2]中溶液，最终配置成鞘磷脂酶液体试剂e。

按以下步骤制备含有鞘磷脂酶，不含有稳定剂的对照液体试剂f：

[1]称取15.7g的三（羟甲基）氨基甲烷和9g氯化钠溶于975ml去离子水中；

[2]在用1mhcl调节溶液[1]ph至8.0，加入鞘磷脂酶1000mg并最终定容为1l，最终配置成含鞘磷脂酶的对照液体试剂f。

将含有稳定剂的液体试剂e和不含稳定剂的对照试剂f同时保存在4℃的冰箱中，每隔30天取出按以下步骤测试其中鞘磷脂酶的活性：

[1]用100mmtris缓冲液配制含有2mmmgcl2、0.6mm鞘磷脂、10u/ml碱性磷酸酶、10u/ml胆碱氧化酶、5u/ml辣根过氧化物酶、1.5mm安替吡啉、0.02%n,n-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(todb)、0.9%氯化钠和0.1%tritonx-100，并将ph调至7.5；

[2]取2个石英比色皿，分别加入3ml上述反应试剂并在37℃孵育5min；

[3]分别取50ul液体试剂e和对照液体试剂f分别加入上述2个石英比色皿中，并用紫外可见分光光度计分别测量其在546nm的吸光度；

[4]使用下列公式计算鞘磷脂酶的活力：

式中，△a=asample-ablank；m(todb)为todb在546nm的摩尔吸光系数,其值为16.0；vt为总反应体积；vs为样品体积；x为样品中酶浓度。

其结果如图3所示，可以看出使用本发明方法保存鞘磷脂酶的酶活力在12月内并没有明显降低，而未使用本发明方法保存的鞘磷脂酶的酶活力大幅下降。