一种亮氨酸氨肽酶3抑制剂的抑酶活性测定方法及应用与流程

本发明涉及化合物抑酶活性测定领域，具体涉及一种亮氨酸氨肽酶3抑制剂的抑酶活性测定方法、酶源制备方法及其应用。

背景技术

亮氨酸氨基肽酶(leucineaminopeptidase，lap)是一种蛋白分解酶，能水解肽链n端并由亮氨酸与其他氨基酸形成肽键的酶，广泛分布于肝、胰、肾等组织中。当人体肝、胆、胰等组织有病变时，均可出现血清lap水平升高。测定血清亮氨酸氨基转肽酶可作为肝病诊断的又一项指标，对淤胆性肝炎的鉴别诊断、肝道梗阻及胰腺癌的诊断有价值。肝内外胆淤时，lap活力显著增高，尤其在恶性胆淤时，其活力随病情进展而持续增高。亮氨酸氨基肽酶(lap)的检测也可早期反映肾损害的性质和程度，并为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供可能的帮助；其亦可作为妊娠合并icp及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项有效指标。

红白血病k562细胞是第一个人类髓性白血病人工培养的细胞，是源自一个53岁的女性慢性髓性白血病爆发期病人的淋巴母细胞。用于研究肿瘤和白血病治疗、药物靶标等领域。

酶活性测定方法有多种，由于酶具有高度的专一催化活性，故可通过测定其相应的底物或产物的浓度变化，或用某一反应产物浓度变化来确定其酶的活性。例如还原法、发色底物法、粘度法、高压液相色谱法、免疫学方法、琼脂凝胶扩散法等。一般采用电化学和光物理的方法，即利用反应物或产物的吸光性，用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体，则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸，则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化，计算酶活性。一些性质稳定的酶，也可用高效液相色谱法检测。而现有技术中关于化合物抑制亮氨酸氨肽酶3酶活的手段并不成熟，尚未有技术成熟、方便购买的试剂盒产品，为科研工作带来诸多不便。

慢病毒(lentivirus)载体是以hiv-1(人类免疫缺陷i型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。本发明所采用的慢病毒(lentivirus)为“自杀”性病毒，其毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代，不具有感染目的细胞后再感染其他细胞的能力，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，属于假型病毒。该慢病毒(lv-lap3)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建、包装和纯化。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种成本经济、操作简单的测定靶向亮氨酸氨肽酶3的化合物的抑酶活性方法。现有技术的酶活测定试剂盒中提供的酶标准品多为从猪肾小体中提取的亮氨酸氨肽酶，与人源的亮氨酸氨肽酶3相比存在较大差异，且价格昂贵。本发明通过构建一种稳定表达人源亮氨酸氨肽酶3的细胞株，用于测定化合物对蛋白酶活的抑制活性，相比现有技术中使用非人源的亮氨酸氨肽酶3作为评价的工具，本发明的方法测得的抑酶活性数据更加可靠。

本发明目的之一在于提供一种测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，该方法特征在于，以能够稳定表达人源lap3的k562-lap3细胞株作为酶源进行化合物抑酶活性的测定。

上述测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，步骤如下：

(1)将pbs清洗后的k562-lap3细胞接种于96孔板中；

(2)向孔中加入不同浓度梯度的化合物；

(3)化合物作用一段时间后加入lap3底物培养；

(4)测定405nm处的吸光度值，计算抑制率：

加药组平均od值＝过表达加药组平均od值-未过表达加药组平均od值

不加药组平均od值＝过表达组平均od值-未过表达组平均od值

优选的，上述步骤(1)中k562-lap3细胞接种于96孔板中，接种密度为1×10⁵个/孔。

优选的，步骤(3)中加入化合物作用5min后，再加入lap3底物至1.6mm，37℃条件下培养30min。

本发明目的之二在于提供上述k562-lap3细胞的构建方法，步骤如下：

(1)加入完全培养液重悬k562细胞，接种于96孔板中培养；

(2)向孔中加入重组慢病毒lv-lap3稀释液，并加入polybrene作为病毒感染辅助剂，培养过夜；

(3)感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的k562细胞，从而获得稳定表达lap3和嘌呤霉素抗性的k562-lap3细胞株。

优选的，上述构建方法中，步骤(1)中k562细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，接种体积为80μl。

优选的，上述构建方法中，步骤(2)中重组慢病毒lv-lap3稀释液的配置方法为：浓度为2×10⁸tu/ml的重组慢病毒lv-lap3原液，用eni.s稀释，使moi为40。

优选的，上述构建方法中，步骤(2)中每孔需要加入重组慢病毒稀释液10μl，病毒感染辅助液polybrene10μl。

优选的，上述构建方法中，步骤(3)的具体操作如下：第二天更换新鲜培养液继续培养，第三天再次更换新鲜培养液，直至感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的k562细胞，2周后待对照组细胞全部死亡时换嘌呤霉素维持浓度为1.0mg/ml的培养液，并不断传代扩增，从而获得稳定表达lap3和嘌呤霉素抗性的k562-lap3细胞株。从成功构建的k562-lap3细胞中筛选阳性细胞单克隆并进行鉴定，从而获得高表达lap3的k562-lap3细胞株。

优选的，上述鉴定阳性单克隆方法为k562-lap3细胞明场荧光成像，k562-lap3与k562细胞的酶活趋势比较以及westernblotting检测lap3蛋白表达水平。

本发明目的之三在于提供一种测定化合物抑制亮氨酸氨肽酶3活性的检测试剂盒，包括pbs溶液、96孔板、lap3底物，其特征在于，还包括通过上述构建方法得到的k562-lap3细胞株。

本发明目的之四在于提供上述化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，在lap3抑制剂类药物评价方面的应用。本发明提供的方法采用以表达人源lap3的k562-lap3细胞株作为酶源，无需重复购买检测标准品；且本发明中的酶源是人源的lap3，相比现有技术中采用猪源的亮氨酸氨肽酶，评价结果更加准确。为lap3抑制剂的评价提供了更为经济、结果更准确的工具，毫无疑问可以应用于lap3抑制剂类药物的评价领域。

本发明的有益效果

1.现有技术中测定lap3抑制剂的抑酶活性需要购买试剂盒进行抑酶活性评价。现有技术中的酶活试剂盒存在如下问题：

(1)试剂盒提供的酶是来源于猪的lap，而猪跟人的lap3结构存在差异，蛋白序列不一致，化合物对猪源的lap的抑制作用与人源的lap3抑制作用存在差异，因此现有技术中试剂盒测得的抑酶活性数据并不可靠。

(2)现有技术中试剂盒价格比较昂贵，为sigma公司进口产品，而本发明提供酶源的方法成本更为经济。

2.k562细胞为悬浮生长的细胞，操作简单。大部分细胞属于贴壁生长的细胞，如作为酶源，测lap3抑制剂活性，培养相对繁琐。

3.lap3属于膜蛋白，在细胞膜外表面表达，只需将抑制剂加入培养液中即可与细胞膜表面的lap3结合，评价抑制剂的活性。

4.现有技术中构建能够稳定表达某种蛋白的k562细胞，往往作为白血病研究的基础工具，可用于诊断和预后判断指标的筛选、靶点对于白血病的作用机制等。也可以用于构建高纯度蛋白对照品，而本发明中作为化合物抑酶活性的酶源在现有技术中还未有记载。基于k562细胞的悬浮特性以及lap3膜外表达的特点，发明人联想到将k562-lap3作为化合物抑酶活性测定的酶源，实现了意料不到的技术效果。并通过检测不同细胞对lap3底物催化效率发现，k562细胞对本发明所用的底物具有较低的催化效率，作为检测工具载体细胞，背景低，对检测精度影响更小。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1.k562-lap3细胞明场成像、荧光成像及两者叠加的图片；

图2.k562-lap3与k562细胞蛋白质免疫印记图片；

图3.k562-lap3与k562细胞的酶活趋势比较；

图4.阳性药bestatin对k562-lap3细胞中lap3酶活的抑制率。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍，现有技术中存在酶活测定试剂盒造价昂贵，准确性第等不足，为了解决如上技术问题，本申请提出一种以k562-lap3作为酶源进行化合物抑酶活性评价地方法。

本发明的一种典型实施方式中，提供一种测定化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，以能够稳定表达人源lap3的k562-lap3细胞株作为酶源进行化合物抑酶活性的测定，步骤如下：

(1)将pbs清洗后的k562-lap3细胞接种于96孔板中；

(2)向孔中加入不同浓度梯度的化合物；

(3)化合物作用一段时间后加入lap3底物培养；

(4)测定405nm处的吸光度值，计算抑制率：

加药组平均od值＝过表达加药组平均od值-未过表达加药组平均od值

不加药组平均od值＝过表达组平均od值-未过表达组平均od值

优选的实施方式中，步骤(1)中k562-lap3细胞接种于96孔板中，接种密度为1×10⁵个/孔。

优选的实施方式中，步骤(3)中加入化合物作用5min后，再加入lap3底物至1.6mm，37℃条件下培养30min。

本发明的另一种具体实施方式中，提供上述k562-lap3细胞的构建方法，步骤如下：

(1)加入完全培养液重悬k562细胞，接种于96孔板中培养；

(2)向孔中加入重组慢病毒lv-lap3稀释液，并加入polybrene作为病毒感染辅助剂，培养过夜；

(3)感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的k562细胞，从而获得稳定表达lap3和嘌呤霉素抗性的k562-lap3细胞株。

优选的的实施方式中，步骤(1)中k562细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，接种体积为80μl。

优选的实施方式中，步骤(2)中重组慢病毒lv-lap3稀释液的配置方法为：浓度为2×10⁸tu/ml的重组慢病毒lv-lap3原液，用eni.s稀释，使moi为40。

优选的实施方式中，步骤(2)中每孔需要加入重组慢病毒稀释液10μl，病毒感染辅助液polybrene10μl。

优选的实施方式中，步骤(3)的具体操作如下：第二天更换新鲜培养液继续培养，第三天再次更换新鲜培养液，直至感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的k562细胞，2周后待对照组细胞全部死亡时换嘌呤霉素维持浓度为1.0mg/ml的培养液，并不断传代扩增，从而获得稳定表达lap3和嘌呤霉素抗性的k562-lap3细胞株。从成功构建的k562-lap3细胞中筛选阳性细胞单克隆并进行鉴定，从而获得高表达lap3的k562-lap3细胞株。

优选的实施方式中，鉴定阳性单克隆方法为k562-lap3细胞明场荧光成像，k562-lap3与k562细胞的酶活趋势比较以及westernblotting检测lap3蛋白表达水平。

本发明的又一种具体实施方式中，提供一种测定化合物抑制亮氨酸氨肽酶3活性的检测试剂盒，包括pbs溶液、96孔板、lap3底物，还包括通过上述构建方法得到的k562-lap3细胞株。

本发明的又一种具体实施方式中，提供上述化合物对亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，在lap3抑制剂药物评价方面的应用。

本发明中使用的重组慢病毒lv-lap3购于上海吉凯基因化学技术有限公司。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明酶源制备方法及其应用于测定化合物的抑酶活性方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。本发明通过慢病毒感染k562细胞过表达lap3作为酶源测定化合物的抑酶活性。

本发明利用k562-lap3细胞明场荧光成像，k562-lap3与k562细胞的酶活趋势比较以及westernblotting检测lap3蛋白表达水平变化，证实k562-lap3细胞中lap3蛋白表达量增高。

以下实施例中lap3底物购于sigma公司，商品名称：l-leucine-p-nitroanilide(l9125；sigma,stlouis,mo,usa)，中文名称：l-亮氨酸-p-硝基苯胺。

实施例1：筛选合适的细胞载体。

为提高酶活测定的准确性，本发明对构建蛋白表达的载体细胞进行了考察，考察对象包括k562、plc、mcf7、a549、ea.hy926。将对数生长期的细胞清洗后计数，以1×10⁵每孔的数量接种于96孔板中，加入lap3底物至1.6mm，每种细胞平行三个孔，分别在0h、0.5h、1h、1.5h测定细胞吸光度，结果如表1所示：

表1不同细胞催化lap3底物发光能力

由表1结果可以看出，k562细胞对lap3底物催化能力最弱，作为酶活检测工具对显色结果影响最小。现有技术中并未公开k562细胞膜表面酶的种类和数量，本发明通过实验证明了将k562用于lap3酶活的测定具有非显而易见的优越性。

实施例2：使用本发明所述方法建立过表达lap3的k562单克隆细胞株。

1.用完全培养液重悬k562细胞，将k562细胞接种于96孔板中，5×10³个/孔，体积为80μl。

2.重组慢病毒lv-lap3原液为2×10⁸tu/ml，用eni.s稀释，使moi为40，每孔加入重组慢病毒lv-k562稀释液10μl，并加入polybrene10μl作为病毒感染辅助剂，培养过夜。

3.第二天更换新鲜培养液继续培养，第三天再次更换新鲜培养液，直至重组慢病毒lv-lap3感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的k562细胞，2周后待对照组细胞全部死亡时换嘌呤霉素维持浓度为1.0mg/ml的培养液，并不断传代扩增，从而获得稳定表达lap3和嘌呤霉素抗性的k562-lap3细胞株。

4.筛选阳性单克隆细胞，获得高表达lap3的k562-lap3细胞株。

结果如图1所示，绿色荧光表明k562细胞感染成功(图1)。

实施例3：使用本发明所述方法westernblotting检测lap3的表达水平。

1.k562和k562-lap3细胞重悬，将k562-lap3细胞及k562细胞重悬，转移到离心管中，1000rpm离心去上清，置于冰盒上加入蛋白质裂解液，采用冻融法充分裂解细胞，4℃，15min，12000rpm离心，取上清。取5μl上清bradford法测定蛋白浓度，剩余上清加入等体积的2×loadingbuffer，100℃加热煮沸5min使蛋白质变性。-70℃保存。

2.5支试管中分别加入20μl、40μl、60μl、80μl、100μlbsa(1μg/ml)，用纯水补足至1ml，同时以1ml纯水调零，取50μl裂解的全细胞蛋白溶液，以纯水补足体积至1ml，每管加入考马斯亮蓝g-250溶液1.4ml，振荡混匀后静置2min，用紫外分光光度计测定od595nm吸光度值，作标准曲线，计算蛋白含量。

3.准备玻璃板，用水洗干净，确定凝胶体积，小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，在顶层加入数毫升双蒸水将液面完全覆盖，以阻止空气对凝胶聚合的抑制作用，室温放置约30min左右，凝胶聚合完成后，倒掉双蒸水，尽可能吸去残余的液体，注入上层浓缩胶，插入梳子，调整梳子的高度，使之合适，应避免产生气泡，室温聚合，胶凝后，取出梳子，双蒸水洗涤梳孔数次，将凝胶放入电泳槽中上下槽均加入tris-甘氨酸电泳缓冲液，检查是否泄露，驱除凝胶底部的气泡，上样前用电泳缓冲液冲洗梳孔，取15ul样品上样，准备电泳，开始时电压为80v，待染料进入分离胶后，将电压增加到100v，电泳直到染料抵达分离胶底部，取下凝胶用于蛋白质免疫印记检测；

①按下表配置10％的分离胶和5％的浓缩胶：

②按下表配置12％的分离胶和5％的浓缩胶：

凝胶电泳完毕后小心取下凝胶，于转移缓冲液中浸泡15min，剪张2滤纸和一张pvdf膜，大小与凝胶相同，置于转移缓冲液中浸泡10min，剪一张pvdf膜，首先把膜放入甲醇中浸泡，然后三蒸水冲洗，再放入转膜缓冲液中浸泡，安装转印装置，将塑料支架放在含有转移缓冲液的托盘中，上放一块海棉将一张滤纸放在海棉上，依次放置凝胶、pvdf膜、另一张滤纸及海棉。放置每移一转膜一层时均要去除气泡塑料支架夹紧上述各层，放入电泳槽中，注意pvdf侧靠近正极，胶一侧靠近负极，接通电源，电流300ma转移2h左右，转移结束后，用剪刀在膜的上缘做好标记，将pvdf膜放在脱脂牛奶中，室温下封闭2h，与一抗反应，将抗体用5％封闭液稀释1：1000-3000，放入pvdf膜，按每平方厘米0.1ml一抗溶液加入一抗稀释液，4℃过夜或室温震摇1-2h，反应完毕，弃去反应液，tbst洗涤3次，每次10min，与二抗反应将二抗在封闭液中稀释一，膜放入袋中，加入二抗稀释液，去除袋内所有气泡封口，室温下振摇1-2h，反应完毕，弃去反应液，tbst洗涤3次，每次10min，将膜置于保鲜膜上，均匀涂上显色底物液，覆上保鲜膜，盖上胶片，置于暗盒曝光，将胶片取出，放入显影液中，室温下轻轻摇动，观察显色反应，直到满意，立刻水洗终止反应，将胶片放入定影液中，轻轻摇动，取出胶片，晾干，凝胶成像分析系统扫描，保存图像。

结果如图2所示，k562-lap3条带颜色明显深于k562表明过表达株细胞表达效果符合预期。

实施例4：使用本发明所述方法对k562-lap3细胞株作酶源进行酶活测定。

1.将k562与k562-lap3细胞分别用pbs洗一边，传于96孔板中，1×10⁵个/孔；

2.向孔中加入lap3底物至1.6mm，30min，37℃；

3.测定405nm处的吸光度值，数据处理。

结果如图3所示，k562-lap3株酶活趋势线斜率明显高于k562株，表明过表达株细胞表达效果符合预期(图3)。

实施例5：使用本发明所述方法测定化合物bestatin对k562-lap3细胞株中lap3酶的抑制率。

1.k562-lap3细胞用pbs洗一遍，传于96孔板中，1×10⁵个/孔；

2.向孔中加入不同浓度的化合物，至终浓度：25、100、400μm；

3.5min后，加入亮氨酸氨肽酶3底物至1.6mm，30min，37℃；

4.间隔30min在405nm下测定吸光度值；

5.计算抑制率：

加药组平均od值＝过表达加药组平均od值-未过表达加药组平均od值

不加药组平均od值＝过表达组平均od值-未过表达组平均od值

结果如图4所示，bestatin对k562-lap3酶活的抑制作用随着加药浓度的增加而升高。

在抗肿瘤药物的新药研发过程中，经常需要测定化合物体外对肿瘤细胞酶活的影响，采用本发明所述方法可以测定化合物对酶活的抑制率。根据抑制率计算公式可以得到bestatin单纯对过表达产生的lap3的抑制率，结果如图4所示，数据表明化合物bestatin能够明显抑制k562-lap3细胞的lap3酶活(图4)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。