一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法。
背景技术：
肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumoniae,k.pneumoniae,kp)是一种革兰氏阴性杆菌，在健康人的呼吸道和肠道正常菌丛中、自然界水和谷物中都能分离到，是重要的条件致病菌之一。当人体抵抗力降低时，肺炎克雷伯杆菌可经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，引起典型的原发性肺炎，还能引起各种肺外感染，包括婴儿肠炎和脑膜炎、泌尿道感染及败血症等。此外，肺炎克雷伯杆菌也是造成无特定病原体动物(specificpathogenfreeanimals,spf)污染的主要微生物之一。当实验动物如大、小鼠，在机体免疫功能下降或处于应激状态时，常因感染肺炎克雷伯杆菌而影响其质量及干扰动物实验，甚至引起动物死亡而造成实验数据和经济上的损失，严重影响到教学及科学研究。因此，肺炎克雷伯菌的检测在临床诊断、食品安全和实验动物等检测中都有着相当重要的意义国家标准(gb14926-2001)规定了实验动物微生物学检测方法，其中肺炎克雷伯杆菌是spf级实验大、小鼠必须检测并排除的病原体之一。利用国标方法进行检测时需要采样、培养、染色、生化反应等多个实验步骤，要1-2天才能完成，而且步骤繁杂，工作量较大。为了能满足spf级实验动物肺炎克雷伯杆菌快速、高通量检测的迫切要求，公开号为cn102080127b申请公开了一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片，其中包括了检测肺炎克雷伯杆菌。但是该基因芯片方法有以下缺点：首先，它需要经过35个循环的pcr、2小时的预杂交、6小时的杂交以及多次清洗等，步骤繁琐，整个检测时间在10个小时以上；其次它需要特定的杂交仪、基因芯片检测仪等昂贵仪器，普适性不强。普通pcr方法可以直接检测病原体核酸，但是一般都需要在pcr完成后进行琼脂糖凝胶电泳分析条带来判断结果，且灵敏度不高。基于taqman探针的实时荧光定量pcr技术比普通pcr技术特异性更强，能实现定量分析，可以提高检测的可靠性，已在多个领域得到应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的实时荧光定量pcr试剂盒和方法。本发明提供了seqidno.1～2所示的引物对、seqidno.3所示的探针。本发明还提供了seqidno.1～2所示的引物对和seqidno.3所示的探针在制备检测肺炎克雷伯杆菌的试剂中的用途。其中，所述试剂是检测实验动物样品、食品、临床样品中的肺炎克雷伯杆菌的试剂。本发明还提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒，包括：dna提取试剂、pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、灭菌水，pcr反应液中用于核酸扩增反应的引物为seqidno.1和seqidno.2所示的引物，pcr反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在seqidno.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。本发明还提供了一种检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)提取样本dna：取待检样本，用dna提取试剂提取待检样本中的dna；(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的pcr反应液、酶混合液、灭菌水按比例混合，对待检样本中的dna进行扩增，扩增程序为94℃1min；94℃5s，60℃10s收集荧光，进行50个循环；(3)结果检测：通过荧光曲线对dna扩增结果进行判定；其中，所述待检样本可以为实验动物回盲部内容物或病灶组织、食品样本、临床咽拭子、鼻咽分泌物或痰液样本。综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测肺炎克雷伯杆菌，特异性和灵敏度高、适用性广、重复性好、检出限低，检测快速简便，成本低廉，可以大量推广使用，应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为肺炎克雷伯杆菌检测方法的特异性验证图。图2为不同浓度肺炎克雷伯杆菌模板dna扩增图。图3为不同浓度模板与ct值的关系图。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。实施例1本发明检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和检测方法一、本发明试剂盒成分包含dna提取试剂、pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品和灭菌水，pcr反应液中用于核酸扩增反应的引物为seqidno.1和seqidno.2所示的引物，pcr反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在seqidno.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。各自序列如表1所示：表1本发明引物及探针注：f为上游引物，r为下游引物，p为探针，荧光探针为在探针p(seqidno.3)的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团，荧光基团可以是fam，淬灭基团可以是bhq，荧光探针结构可以为5’-fam-seqidno.3-bhq-3’。二、采用本发明试剂盒检测肺炎克雷伯杆菌1、采取dna提取试剂提取样品的dna2、定量pcr扩增配制定量pcr扩增体系：在冰盒中配制如下反应体系，反应体系为25μl：在各设定的反应管中分别加入制备好的样品dna溶液，盖紧管后混匀，6000r/min离心5s～10s。将密封好的反应管转移至扩增区。实时荧光pcr检测：a)将上一步离心后的反应管放入实时荧光pcr检测系统内，记录样本摆放顺序。b)实时荧光pcr反应条件：94℃1min→50×(94℃5s→60℃10s收集荧光)。c)检测结束后，根据扩增曲线和ct值判定结果。3、结果判定与表述：阈值设定原则：阈值设定为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×stddev[cycle(3-15)]。有效性原则:以下条件有一条不满足时，实验视为无效；a)空白对照：无fam荧光信号检出或ct值≥45.0，未出现典型的扩增曲线。b)阴性对照：无fam荧光信号检出或ct值≥45.0，未出现典型的扩增曲线。c)阳性对照：有fam等荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，ct值＜30.0。样品检测：a)当检测体系有fam荧光信号检出，且ct值＜45.0，并出现典型的扩增曲线时，判定被检样品为阳性。b)当45.0≤ct值≤50.0时，且有典型的扩增曲线时，则需重复实验。再次扩增后检测体系的ct值仍≤45.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品为阳性。当再次扩增后，检测体系ct值＞45.0，或无典型的扩增曲线，则判定被检样品为阴性。结果的表述：结果为阳性者，表述为“检出肺炎克雷伯杆菌dna”；结果为阴性者，表述为“未检出肺炎克雷伯杆菌dna”。以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：试验例1本发明试剂盒及方法的特异性检测分别以肺炎克雷伯杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌o157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、枯草芽孢杆菌共计10种细菌已验证的基因组dna为模板，用实施例1的试剂盒及方法，进行real-timepcr扩增。扩增结束后，通过观察对不同模板dna的扩增曲线及ct值来判定其特异性。若无典型扩增曲线且ct值大于45或无ct值，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。实验结果见图1。结果显示，10种细菌dna中，仅有肺炎克雷伯杆菌dna样品有ct值，有典型扩增曲线且平均ct值为23.32，小于45，判定为含有肺炎克雷伯杆菌dna，其它细菌均未检出，特异性验证结果理想。可见，本发明方法和试剂盒的检测结果与样本的实际情况一致，说明本发明方法和试剂盒特异性好，可以准确检测肺炎克雷伯杆菌。试验例2本发明试剂盒及方法的灵敏度检测取已验证的肺炎克雷伯杆菌dna，按浓度梯度进行倍比稀释作为反应模板(模板浓度分别为6copies/μl、60copies/μl、6×102copies/μl、6×103copies/μl、6×104copies/μl、6×105copies/μl、6×107copies/μl)，用实施例1的试剂盒及方法，进行扩增反应。确定模板dna浓度范围与ct值线性关系，同时根据公式，计算检测方法的扩增效率。并确定模板dna的灵敏度。结果见表2和图2-3。表2不同浓度模板的ct值模板浓度ct值6copies/μl/60copies/μl39.796×102copies/μl36.756×103copies/μl33.266×104copies/μl29.896×105copies/μl27.626×107copies/μl22.01结果显示，当模板dna浓度在60copies/μl至6×107copies/μl间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系好(相关系数99.6％)，扩增效率高，为116.94％。当阈值设为45个循环时，dna检测的灵敏度为60copies/μl，灵敏度高。综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测肺炎克雷伯杆菌，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。序列表<110>中国科学院成都生物研究所,四川省中医药科学院中国科学院成都生物研究所,四川省中医药科学院中国科学院成都生物研究所,四川省中医药科学院<120>一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法<130>一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>artificial<400>1cgaaggccgtgaagcgaagaaac23<210>1<211>22<212>dna<213>artificial<400>1tggtacggtcggagctggtgta22<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<400>1cggcgtcggcacctcgttaa20当前第1页12