本发明属于天然药物医药技术领域，涉及复方中药中的黄酮类化合物，尤其是涉及一种黄酮类化合物芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷及其制备方法和应用。
背景技术：
中药复方所包含的组分十分复杂，既含有许多有效成分、又有无效成份，也包含有毒成份。提取其有效成分并进一步加以分离、纯化，得到有效单体是中药研究领域中的一项重要内容。本课题研究了一个中药复方，其组分包括：紫草，丹参，地骨皮，白芨，防风，当归，川芎，透骨草，甘草。此复方是一个祖传秘方，在临床上有很好的疗效，是一剂治愈白癜风的优良配方。该复方成分虽然复杂，但大多数单味药材皆包含黄酮类物质，如透骨草、当归、甘草、地骨皮和川穹等。谭辉利用正丁醇和乙酸乙酯浸泡透骨草，提取物用硅胶柱层析多次纯化，分离出几种化合物。有芹菜素和豆甾醇等。当归中主要含黄酮、有机酸等多种类型的化合物，其中黄酮类物质具有抗衰老和免疫调节等作用，为白癜风治疗提供了依据。甘草是多年生草本植物，含有苯甲酸钠和黄酮等多种有机物成分，具有抗抑郁的效果，利用高效液相色谱法可以区分甘草各组分的含量与占比。地骨皮的内部有效成分是由生物碱类和黄酮类物质组成，它对于抵抗自由基的侵袭十分有效。川芎为伞形科草本植物，主要含有苯酚、生物碱、黄酮等成分，具有改善微环境，抗氧化的功能，对于白癜风治疗也有良好效果。
白癜风是一种后天形成的慢性的皮肤紊乱疾病，以黑色素细胞破坏和色素斑脱失为特征。由于白癜风的发病区域暴露于皮肤表面，不仅会给患者带来身体负担，还会给患者带来严重的心理影响。该疾病在世界范围内的发病率约为1％，正严重威胁人类的健康。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种中药复方中黄酮类化合物及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种中药复方中黄酮类化合物，分子式为c25h26o10，命名为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷，化学结构式如式(i)所示：
所述的中药复方中黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备中药复方：
该中药复方包括白芨、川芎、甘草、紫草、丹参、当归、防风、地骨皮和透骨草；
(2)提取：
将一剂中药复方在超纯水中煎煮后，收获中药水提液，减压浓缩后，用乙酸乙酯对浓缩液进行萃取，浓缩后得到乙酸乙酯提取物；
(3)粗分：
将乙酸乙酯提取物加入到超纯水中，并采用超声促进溶解，经大孔吸附树脂吸附后，依次用蒸馏水、20～30％乙醇、50～60％乙醇、70～80％乙醇和90～100％乙醇将样品从柱子上洗脱下来，收集70～80％乙醇洗脱部分，减压浓缩得到粗提物；
(4)精制：
将粗提物用甲醇溶解并过滤后，上样于sephadexlh-20柱进行分离，分离过程中用40％甲醇-水溶液洗脱，并收集40％甲醇-水溶液洗脱馏分，低温存储备用；
(5)纯化：
经sephadexlh-20柱分离产物，以硅胶拌样，经硅胶柱层析，然后以氯仿和甲醇体积比100:(1～25)的洗脱液梯度洗脱，进行分离，每份洗脱液均为一倍柱体积，流出液每4～5ml收集一份，保留第29～31份洗脱馏分，回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得到所述的芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷单体成分。
优选地，一剂中药复方由白芨12g、川芎9g、甘草6g、紫草15g、丹参12g、当归10g、防风10g、地骨皮12g和透骨草6g组成。
优选地，步骤(2)中，超纯水的使用量为1～2l，煎煮过程中，浸泡时间为2～3h，熬制时间为3～4h，中药水提液的收获量为200～400ml，减压浓缩的温度为40～60℃，萃取过程中按浓缩液与乙酸乙酯的体积比1:(2～5)进行，并重复2～3次，浓缩前合并萃取液。
优选地，步骤(3)中，所述的超纯水的使用量为乙酸乙酯提取物总重量的15～20倍；大孔吸附树脂吸附过程中，乙酸乙酯提取物与树脂的质量比1:(6～10)；减压浓缩温度为45℃。
优选地，步骤(3)中，大孔吸附树脂采用ab-8树脂。
优选地，步骤(4)中，以0.22μm滤膜过滤；分离采用的sephadexlh-20柱长30cm，内径1.5cm；分离过程中，采用湿法上样，采用10％甲醇平衡色谱柱，上样体积占总体积的1％，洗脱液流速为1ml/min；洗脱馏分在-20℃的低温下存储备用。
优选地，步骤(5)中，分离过程中，采用的色谱柱内径1.5cm，柱内填料高30cm，以氯仿和甲醇按体积比100:1的混合溶剂作为平衡硅胶柱的有机溶液，洗脱过程中保持1ml/min的恒定流速。
优选地，步骤(5)中，洗脱过程中，按照氯仿和甲醇的体积比为100:1、100：10、100：15、100：20和100：25的洗脱液依次洗脱。
所述的中药复方中黄酮类化合物在促黑素生成方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对中药复方中成分复杂、活性成分结构不确定的突出问题，采用萃取、层析、质谱及核磁等方法鉴定出复方中有效成分的结构，建立了一种中药复方的分离纯化与结构鉴定的方法，为中药组分分析和中药治疗白癜风的机制研究提供了参考依据。
附图说明
图1为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷的hplc图；
图2为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷的质谱图；
图3为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷对b16细胞增殖的影响；
图4为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷对b16细胞酪氨酸酶活性的影响；
图5为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷对b16细胞黑素含量的影响；
图6为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷对mrc-5细胞增殖的影响。
具体实施方式
一种中药复方中黄酮类化合物，分子式为c25h26o10，命名为芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷，化学结构式如式(i)所示：
所述的中药复方中黄酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备中药复方：
该中药复方包括白芨、川芎、甘草、紫草、丹参、当归、防风、地骨皮和透骨草；
(2)提取：
将一剂中药复方在超纯水中煎煮后，收获中药水提液，减压浓缩后，用乙酸乙酯对浓缩液进行萃取，浓缩后得到乙酸乙酯提取物；
(3)粗分：
将乙酸乙酯提取物加入到超纯水中，并采用超声促进溶解，经大孔吸附树脂吸附后，依次用蒸馏水、20～30％乙醇、50～60％乙醇、70～80％乙醇和90～100％乙醇将样品从柱子上洗脱下来，收集70～80％乙醇洗脱部分，减压浓缩得到粗提物；
(4)精制：
将粗提物用甲醇溶解并过滤后，上样于sephadexlh-20柱进行分离，分离过程中用40％甲醇-水溶液洗脱，并收集40％甲醇-水溶液洗脱馏分，低温存储备用；
(5)纯化：
经sephadexlh-20柱分离产物，以硅胶拌样，经硅胶柱层析，然后以氯仿和甲醇体积比100:(1～25)的洗脱液梯度洗脱，进行分离，每份洗脱液均为一倍柱体积，流出液每4～5ml收集一份，保留第29～31份洗脱馏分，回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得到所述的芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷单体成分。
优选地，一剂中药复方由白芨12g、川芎9g、甘草6g、紫草15g、丹参12g、当归10g、防风10g、地骨皮12g和透骨草6g组成。
优选地，步骤(2)中，超纯水的使用量为1～2l，煎煮过程中，浸泡时间为2～3h，熬制时间为3～4h，中药水提液的收获量为200～400ml，减压浓缩的温度为40～60℃，萃过程中取按浓缩液与乙酸乙酯的体积比1:(2～5)进行，并重复2～3次，浓缩前合并萃取液。
优选地，步骤(3)中，所述的超纯水的使用量为乙酸乙酯提取物总重量的15～20倍；大孔吸附树脂吸附过程中，乙酸乙酯提取物与树脂的质量比1:(6～10)；减压浓缩温度为45℃。
优选地，步骤(3)中，大孔吸附树脂采用ab-8树脂。
优选地，步骤(4)中，以0.22μm滤膜过滤；分离采用的sephadexlh-20柱长30cm，内径1.5cm；分离过程中，采用湿法上样，采用10％甲醇平衡色谱柱，上样体积占总体积的1％，洗脱液流速为1ml/min；洗脱馏分在-20℃的低温下存储备用。
优选地，步骤(5)中，分离过程中，采用的色谱柱内径1.5cm，柱内填料高30cm，以氯仿和甲醇按体积比100:1的混合溶剂作为平衡硅胶柱的有机溶液，洗脱过程中保持1ml/min的恒定流速。
优选地，步骤(5)中，洗脱过程中，按照氯仿和甲醇的体积比为100:1、100：10、100：15、100：20和100：25的洗脱液依次洗脱。
所述的中药复方中黄酮类化合物在促黑素生成方面的应用。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷的制备方法
(1)：中药复方组成：本课题研究的中药复方组分为：白芨12g，川芎9g，甘草6g，紫草15g，丹参12g，当归10g，防风10g，地骨皮12g，透骨草6g。在临床上有很好的疗效，是一剂治愈白癜风的优良配方。
(2)：提取：将一剂中药复方(92g)浸于1l的超纯水中浸泡2h后，以药罐慢火熬制3h。经过煎煮，收获280ml的中药水提液，55℃下减压浓缩。按浓缩液：乙酸乙酯＝1:(2～5)(v:v)进行萃取，重复2～3次，合并乙酸乙酯提取液，浓缩得乙酸乙酯提取物。
(3)：粗分：称取乙酸乙酯提取物重量10倍左右的ab-8树脂。将树脂放入烧杯，加足量无水乙醇浸渍4个小时后。用超纯水反复清洗，直至无醇味。采用湿法上样法。在乙酸乙酯萃取液的浸膏中加超纯水，超声促进溶解，溶液加到制备好的树脂吸附柱上。下端慢慢流出液体，流速为1ml/min。流出的液体用小烧杯接住，再倒回层析柱中，此步骤重复1～2次。依次用60ml的蒸馏水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇将样品从柱子上洗脱下来，收集各部分洗脱液。
(4)：精制:收集ab-8树脂吸附后，75％乙醇洗脱部分(0.6g)，用10ml甲醇溶解，以0.22μm滤膜过滤。sephadexlh-20(15g)在甲醇里浸泡4h。溶胀的sephadexlh-20浆倒入柱子(长30厘米，内径1.5厘米)。上样前，50ml的10％甲醇平衡色谱柱，不使柱子与空气接触。将滤液上柱，洗脱运行如下：40％甲醇-水溶液，在1ml/min恒速流量下。根据tlc结果，富集各个组分，旋转蒸发。富集过程重复两次。富集的样本存储在-20℃，为随后的硅胶柱作准备。
(5)：纯化：经sephadexlh-20柱子所富集得到的样品(0.332g)。加入甲醇/氯仿(v:v)＝1:100的混合溶剂10ml溶解。加入预处理(110℃，烘烤2h)过的硅胶3g，将其与样品搅拌均匀后，干燥。称取预处理过的硅胶(110℃，烘烤2h)30g，用氯仿/甲醇(v:v)＝100:1的混合溶剂50ml溶解，搅拌为匀浆后缓缓加入到色谱柱中(柱长30厘米，柱子内径1.5厘米)。以氯仿/甲醇(v:v)＝100:1的混合溶剂作为平衡硅胶柱的有机溶液。柱子装好以后，在溶剂水平面距离硅胶柱平面还有3mm时加入上述制备好的干燥的含有样品的暗红色粉末，开始洗脱。洗脱按照氯仿/甲醇(v:v)＝100:1、100：10、100：15、100：20、100：25的洗脱液依次洗脱，并且每份洗脱液均为30ml(该数值根据硅胶柱的填充体积确定，本实施例中硅胶柱的填充长度为17cm，柱体积约为30ml)。过程中始终保持1ml/min的恒定流速。流出来的洗脱液以每4ml收集一份，收集第31份洗脱馏分。回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得化合物芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷单体成分0.042g。
(6)：结构鉴定：利用光谱技术，包括高效液相色谱、质谱和核磁共振氢谱法鉴定其结构。
该中药复方中黄酮类化合物波谱数据如下：
该化合物为淡黄色粉末，高效液相色谱结果如图1显示，其主要出峰时间为6.724min，峰面积可达96％以上，收集该峰用于后续的质谱与核磁检测。质谱图如图2所示，其ei-msm/z：486[m-h]ˉ，可推知其分子式为c25h26o10。
淡黄色粉末的核磁共振氢谱为：1hnmr(400mhz,dmso-d6)谱出现两个活泼氢信号δh10.58(1h，s，8-oh)，8.31(1h，s，4，-oh)；五个苯环上的氢信号δh7.83(1h，s，7-h)，7.40(1h，s，6-h)，6.96(1h，s，5-h)，6.55(1h，s，3-h)，6.25(1h，s，2-h)；糖基上的3个羟基氢信号δh5.45(1h，m，17-oh)，5.28(1h，s，15-oh)，4.95(1h，s，14-oh)；糖基上的2个氢信号δh4.89(1h，d，j＝7.1hz，11-h)，4.55(1h，t，j＝5.7hz，10-h)；及6个甲基氢信号δh4.06(2h，m，17-2h),3.46(4h，dt，j＝11.7,5.7hz，9,12-4h)。从核磁共振氢谱图可以看出各个位置上的氢以及相应的官能团。结合图1和2的图谱，解析出其结构为化合物芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷。
药理研究
对b16细胞黑素生成的促进作用
1.模式细胞及实验方法：
小鼠黑色素瘤细胞b16细胞购买自中国科学院上海生命科学学院细胞典藏中心，人体正常细胞mrc-5来自华东理工大学赵健教授惠赠。细胞培养于含酚红的rpmi1640培养基中，该培养基中含有10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素和2mm的谷氨酰胺。置于37℃，co2占比为5％，湿度合适的细胞培养箱中培养。使用mtt法检测细胞增殖，采用多巴速率氧化法检测细胞的酪氨酸酶活性，采用naoh裂解法检测细胞的黑素含量。
2.检测指标：
ab16细胞和mrc-5细胞细胞增殖情况(分别见图3和图6)；
b细胞酪氨酸酶活性变化(见图4)；
c细胞黑素含量变化(见图5)；
从图3可以看出：b16细胞在加药处理之后没有表现出增殖或者抑制的情形。这与前面的药物处理后结果基本相一致。并且，相较于对照组，单体对于细胞的最高抑制率和最大增殖率的范围均在5％之间。说明在0～100μg/ml的单体药物浓度范围内，细胞基本未受影响，能够进行下一轮的细胞酪氨酸酶活性测定与黑素含量的鉴定。
从图4可以看出：在浓度为6.25～25.00μg/ml时，细胞的酪氨酸酶活性变化不明显，而当单体药物的浓度在50～100μg/ml时，酪氨酸酶活性有显著增强，伴随浓度增大，酶活也有增加。增幅分别达到14％和18％。因此，在细胞增殖基本不变的情形下，酪氨酸酶的活性显著上升。
从图5可以看出：细胞增殖未受多少影响的前提下，细胞内的黑素含量有着明显的增加。并且此现象从第一个浓度6.25μg/ml就开始了，其增幅达到了17％。并且随着浓度的增加，黑素含量也在不断的攀升。在12.50、25.00、50.00、100.00μg/ml时的黑素含量相比于对照组的细胞增幅分别达到21％、31％、34％和50％。最大的增长幅度于最大的药物浓度下达到。
从图6可以看出：：芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷对于人胚胎成纤维细胞mrc-5具有轻微的杀伤作用，这种作用伴随浓度增加而增大。在药物浓度达到100μg/ml时，此单体杀伤了43％的细胞，视为最高抑制率。虽然药物对于细胞有一定的抑制效果，但是总体上来说，单体浓度在0～50μg/ml范围内，此药物对于细胞的杀伤效果不大。
3.实验结果：
结果表明：芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷能够在不影响人体正常细胞的细胞增殖的情况下，显著提升b16细胞的酪氨酸酶的活性以及黑素含量。为此中药配方治疗白癜风过程中起关键作用的化合物之一。
实施例2
(1)：中药复方组成：与实施例1相同。
(2)：提取：将一剂中药复方(92g)浸于2l的超纯水中浸泡2h后，以药罐慢火熬制3.5h。经过煎煮，收获400ml的中药水提液，60℃下减压浓缩。按浓缩液：乙酸乙酯＝1:2(v:v)进行萃取，重复2～3次，合并乙酸乙酯提取液，浓缩得乙酸乙酯提取物。
(3)：粗分：称取乙酸乙酯提取物重量6倍左右的ab-8树脂。将树脂放入烧杯，加足量无水乙醇浸渍4个小时后。用超纯水反复清洗，直至无醇味。采用湿法上样法。在乙酸乙酯萃取液的浸膏中加超纯水，超声促进溶解，溶液加到制备好的树脂吸附柱上。下端慢慢流出液体，流速为1ml/min。流出的液体用小烧杯接住，再倒回层析柱中，此步骤重复1～2次。依次用40ml的蒸馏水、30％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、100％乙醇将样品从柱子上洗脱下来，收集各部分洗脱液。
(4)：精制:收集ab-8树脂吸附后，80％乙醇洗脱部分，用10ml甲醇溶解，以0.22μm滤膜过滤。sephadexlh-20(15g)在甲醇里浸泡4h。溶胀的sephadexlh-20浆倒入柱子(长30厘米，内径1.5厘米)。上样前，50ml的10％甲醇平衡色谱柱，不使柱子与空气接触。将滤液上柱，洗脱运行如下：40％甲醇-水溶液，在1ml/min恒速流量下。根据tlc结果，富集各个组分，旋转蒸发。富集过程重复两次。富集的样本存储在-20℃，为随后的硅胶柱作准备。
(5)：纯化：经sephadexlh-20柱子所富集得到的样品。加入甲醇/氯仿(v:v)＝1:100的混合溶剂10ml溶解。加入预处理(110℃，烘烤2h)过的硅胶3g，将其与样品搅拌均匀后，干燥。称取预处理过的硅胶(110℃，烘烤2h)30g，用氯仿/甲醇(v:v)＝100:1的混合溶剂50ml溶解，搅拌为匀浆后缓缓加入到色谱柱中(柱长30厘米，柱子内径1.5厘米)。以氯仿/甲醇(v:v)＝100:25的混合溶剂作为平衡硅胶柱的有机溶液。柱子装好以后，在溶剂水平面距离硅胶柱平面还有3mm时加入上述制备好的干燥的含有样品的暗红色粉末，开始洗脱。洗脱按照氯仿/甲醇(v:v)＝100:1、100：10、100：15、100：20、100：25的洗脱液依次洗脱，并且每份洗脱液均为30ml。过程中始终保持1ml/min的恒定流速。流出来的洗脱液以每5ml收集一份，收集第29份洗脱馏分。回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得到化合物芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷单体成分。
实施例3
(1)：中药复方组成：与实施例1相同。
(2)：提取：将一剂中药复方(92g)浸于1.5l的超纯水中浸泡2.5h后，以药罐慢火熬制4h。经过煎煮，收获200ml的中药水提液，40℃下减压浓缩。按浓缩液：乙酸乙酯＝1:5(v:v)进行萃取，重复2次，合并乙酸乙酯提取液，浓缩得乙酸乙酯提取物。
(3)：粗分：称取乙酸乙酯提取物重量8倍左右的ab-8树脂。将树脂放入烧杯，加足量无水乙醇浸渍4个小时后。用超纯水反复清洗，直至无醇味。采用湿法上样法。在乙酸乙酯萃取液的浸膏中加超纯水，超声促进溶解，溶液加到制备好的树脂吸附柱上。下端慢慢流出液体，流速为1ml/min。流出的液体用小烧杯接住，再倒回层析柱中，此步骤重复1～2次。依次用40ml的蒸馏水、20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇将样品从柱子上洗脱下来，收集各部分洗脱液。
(4)：精制:收集ab-8树脂吸附后，70％乙醇洗脱部分，用10ml甲醇溶解，以0.22μm滤膜过滤。sephadexlh-20(15g)在甲醇里浸泡4h。溶胀的sephadexlh-20浆倒入柱子(长30厘米，内径1.5厘米)。上样前，50ml的10％甲醇平衡色谱柱，不使柱子与空气接触。将滤液上柱，洗脱运行如下：40％甲醇-水溶液，在1ml/min恒速流量下。根据tlc结果，富集各个组分，旋转蒸发。富集过程重复两次。富集的样本存储在-20℃，为随后的硅胶柱作准备。
(5)：纯化：经sephadexlh-20柱子所富集得到的样品。加入甲醇/氯仿(v:v)＝1:100的混合溶剂10ml溶解。加入预处理(110℃，烘烤2h)过的硅胶3g，将其与样品搅拌均匀后，干燥。称取预处理过的硅胶(110℃，烘烤2h)30g，用氯仿/甲醇(v:v)＝100:1的混合溶剂50ml溶解，搅拌为匀浆后缓缓加入到色谱柱中(柱长30厘米，柱子内径1.5厘米)。以氯仿/甲醇(v:v)＝100:10的混合溶剂作为平衡硅胶柱的有机溶液。柱子装好以后，在溶剂水平面距离硅胶柱平面还有3mm时加入上述制备好的干燥的含有样品的暗红色粉末，开始洗脱。洗脱按照氯仿/甲醇(v:v)＝100:1、100：10、100：15、100：20、100：25的洗脱液依次洗脱，并且每份洗脱液均为30ml。过程中始终保持1ml/min的恒定流速。流出来的洗脱液以每4ml收集一份，收集第30份洗脱馏分。回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得到化合物芹菜素-7-丁烯-葡萄糖苷单体成分。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。