本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及检测乳腺癌脑转移的mirna组合及含有该组合的试剂盒。
背景技术：
乳腺癌是现代女性发病首位恶性肿瘤，而其死亡率长期位居女性所有肿瘤死亡中的前五位。在全世界范围内乳腺癌发病率依然在逐步上升，有报道称截止到2015年，发病率约占女性全部恶性肿瘤的27%。乳腺癌是较易发生脑转移的癌症，占脑转移癌第二位，约10％~16％。我国乳腺癌的发病率也以3%-4%的增长率增长，高于全球同类疾病平均水平。据报道，大约25%-40%的乳腺癌患者可能复发或出现转移。其中有症状的脑转移瘤占所有乳腺癌转移患者的6%-16%。目前常用的是病理学诊断，虽然病理学诊断特异性高，但具有创伤性，不易为患者接受，且取材存在一定难度。此外，乳腺癌脑转移的隐匿性极强，早期无任何征兆，通过病理学确诊时已错过最佳治疗时间窗，影响患者的预后，导致患者生存时间显著缩短。另外，计算机断层扫描（ct）、磁共振成像（mri）等影像学技术进行诊断也难以发现恶性肿瘤脑转移早期微小病灶，且患者受经济条件制约等因素未能接受连续的影像学检查。2016年以来，分子分型正逐步应用于神经系统肿瘤的诊断，在2016年who中枢神经系统肿瘤分类中提出多项神经系统肿瘤相关的分子遗传学改变的基因检测。因此，急需更好的乳腺癌脑转移风险评估手段来解决上述问题。
近年来，许多学者致力于包括一些基因标记、血清学标记和细胞学标记等来进行肿瘤个体复发转移风险的评估，但由于这些指标的特异性和敏感性各有差异，随着rna作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，rna比受体、蛋白等出现得更早，而这对寻找有效的预测恶性肿瘤脑转移的标志物尤为重要。
微小rna（mirna）是一种小核rna，长约22个核苷酸，不编码蛋白质，但可以与信使rna（mrna）结合并在基因调控中起重要作用。mirna几乎参与调控细胞活动的各个环节。大量研究表明mirna在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用，并能同时调节多个靶基因，参与肿瘤的发生发展。mirna不仅在组织中，也在体液（血液，尿液，脑脊液）中稳定存在。脑脊液直接与中枢相连，参与脑和脊髓的物质代谢，中枢神经系统发生病变时，mirna可从病变组织释放入脑脊液。因此脑脊液中存在大量脑和脊髓组织来源的mirna,其表达改变能充分反映中枢的病变情况。目前，尽管脑脊液的细胞学分析也可表明存在癌细胞，但csf的细胞学分析灵敏度较低，是非定量的，在技术上具有挑战性。
鉴于目前对乳腺癌脑转移检测灵敏度低等的现状。现有专利中，申请号为cn200680036598.3的专利公开了通过采用微阵列探针法检测受试者的癌细胞中mir-10b，mir-21，mir-122等几十种mirna组合确定乳腺癌预后情况，但并没有说明该检测的mirna组合是否跟脑转移相关，只是确定患者是否有患乳腺癌的风险；申请号为cn201680076769.4的专利公开了通过检测血液中mir-181c，预测癌症脑转移，但随着癌症研究的深入发展，由于肿瘤异质性存在，单靠某一种标志物去诊断疾病，影响因素太多，不如联合诊断的价值大；另外，有报道称血清中mir-181c，mir-21参与肿瘤的恶性病变与转移相关，且申请号：cn201510090768.7公开mir-21能预示乳腺癌早期诊断，但对于乳腺癌脑转移来讲，由于血浆/血清中的mirna表达丰度普遍较低，且来源不明，采用血清或者血浆并不能准确判断病人是否存在脑转移。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种制备方法简单、准确性高、适用性广的检测乳腺癌脑转移的mirna组合及含有该组合的试剂盒。
发明人对乳腺癌脑转移进行了详细研究，前期采用上海康成生物mirna表达谱芯片检测了10名乳腺癌脑转移患者，10名与之年龄性别匹配乳腺癌非转移人群脑脊液mirna的表达情况，筛选出一系列表达差异倍数在2.5倍以上的候选mirna，进一步在大样本乳腺癌脑转移病例与非脑转移对照人群中通过rt-qpcr法验证候选mirna的表达水平，发现5条mirna与乳腺癌脑转移呈正相关，因此通过检测乳腺癌患者脑脊液中mirna的表达水平，可以预测乳腺癌患者脑转移的风险，为开展相应的预防及治疗措施做好准备。
为实现上述目的，本发明提供了检测乳腺癌脑转移的mirna组合，包括mir-10b分子，以及mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c分子中的一个或多个，所述mirna分子的序列号及序列见表1，mirna的表达趋势及外参基因见表2。
用于检测乳腺癌脑转移的试剂盒，包括上述检测乳腺癌脑转移的mirna组合的正反向引物、外参u6rna的正反向引物、脑脊液rna提取系统、逆转录试剂、pcr扩增试剂和cdna混合阳性对照品。
优选的，所述mirna和外参u6rna的正反向引物的核苷酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12所示（见表4）。
优选的，所述cdna混合阳性对照品的制备方法为：将50例乳腺癌脑转移人群脑脊液样本提取的总rna混合后，逆转录后得cdna混合阳性对照品，作为检测引物系列的可行性的阳性质控品。
优选的，所述脑脊液rna提取系统包括裂解液、hibindrna结合柱、rnawashbufferi、rnawashbufferii和收集管。
优选的，所述逆转录试剂为5×iscriptreactionmix、iscriptreversetranscriptase和rnasefreedh2o。
优选的，所述pcr扩增试剂为5×faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)和rnasefreedh2o。
在用本发明的试剂盒进行检测乳腺癌脑转移时，首先检测mir-10b分子，然后再对其他mirna分子进行检测，上述检测乳腺癌是否出现脑转移患者的mirna表达差异情况分三种：（1）mir-10b分子，以及mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c分子中的一个或多个均阳性表达，此时说明患者出现脑转移;（2）mir-10b阴性表达，但是mir-200a、mir-122、mir-21、mir181c分子中的两个或两个以上均阳性表达，此时说明患者出现脑转移;（3）mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c分子均阴性表达，此时说明患者未出现脑转移，建议定期复查。
优选的，本发明试剂盒中还含有其使用说明书。
本发明的有益效果是：
(1)通过芯片及rt-qpcr验证从脑脊液中筛选的一组在乳腺癌脑转移及非脑转移患者之间差异表达的mirna，筛选出的mirna组合可以评估乳腺癌患者癌细胞脑转移的增殖和侵袭能力，进一步指导临床治疗。
(2)将筛选出一组mirnas作为乳腺癌检测预后的分子标记物，制备通过采用荧光定量/数字pcr方法来用于乳腺癌预后检测的试剂盒或生物芯片，可以避免由于肿瘤异质性所带来的低差异和低灵敏性，可有效提高乳腺癌病人预后效果评价从而指导临床治疗指南。能够避免乳腺癌肿瘤异质性带来的检测误差，提高了诊断的准确性。
(3)采用一组mirnas作为新的乳腺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服由肿瘤异质性所带来的低差异和低灵敏性，可有效提高乳腺癌病人预后效果评价从而指导临床治疗指南。
附图说明
图1为脑脊液mir-10b单独诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc(receiveroperationcharacterization)曲线；
图2为脑脊液mir-200a单独诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc曲线；
图3为脑脊液mir-122单独诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc曲线；
图4为脑脊液mir-21单独诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc曲线；
图5为脑脊液mir-181c单独诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc曲线；
图6为五条mirna联合诊断乳腺癌脑转移与非脑转移的roc曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
mirna小分子标志物组合对预示乳腺癌脑转移的准确性验证
一、材料和方法
1.一般资料
所有的研究对象均为2016年11月到2018年3月住院患者（汉族中国人），共116例。根据有无脑转移将研究组患者分为两组：（1）乳腺癌脑转移组（研究组）：48例，年龄25-71岁；纳入标准：1）均经影像学及病理学检查确诊为乳腺癌患者且无其他系统肿瘤；2）脑脊液收集前未接受手术及放化疗；排除标准：1）：排除其他系统肿瘤、糖尿病、高血压及心脑血管疾病；2）排除合并自身免疫性疾病及严重心、肺、肝、肾功能障碍者；3）排除脑脊液收集前未接受手术及化疗放疗。（2）非脑转移组（对照组）：68例，年龄25-75岁。对照组包括经病理组织学或细胞学确诊为乳腺癌但非转移患者和非肿瘤性神经系统疾病患者包括帕金森、癫痫、偏头痛、脊髓炎、痴呆、神经病、小脑良性病变等非肿瘤性神经系统疾病患者。收集人群的临床资料及脑脊液样本。研究组和对照组在性别、年龄间无统计学差异(p＞0.05)。
2.主要仪器设备
立式压力蒸汽灭菌器（ldzm-60kcs，上海申安医疗器械厂），低速离心机（安徽嘉文仪器有限公司），台式离心机(德国eppendorf公司)，水浴锅（国华有限公司），pcr仪（bio-rad），荧光定量pcr仪（bio-rad-cfx-96），核酸蛋白检测仪（美国thermoscience公司），电泳仪（dyy-bc型，北京市六一仪器厂），涡旋机（上海康华生化仪器制造有限公司）。
3.脑脊液采集
乳腺癌脑转移患者确诊后进行脑脊液样本采集，对照组入组后进行脑脊液样本采集。采集方法如下，腰穿后留取脑脊液2ml，放入rnasefreeep管内；在留取脑脊液样本后6h之内用微离心机离心(3000转/分)10min，清除样品中细胞和碎片，抽取上层所有清亮液体分别放入rnasefreeep管内，每个管至少放200ul，保存至-80℃冰箱。在使用玻璃器皿的情况下，请使用干热灭菌，或者在0.1%depc溶液中，37℃下浸泡12h，然后再进行高温高压湿热灭菌（121℃，30min）。
4.脑脊液总rna提取
（1）预处理：在室温下较少rna酶的清洁区，把脑脊液样品解冻；
（2）将100μl的脑脊液加入到1.5ml的离心管中，加入1ml裂解液（rna-solv-reagent），并在室温下静置2-3min。
（3）分离阶段：每1mlrna-solv-reagent加入200μl氯仿，盖紧管盖，涡旋15s，置于冰上10min，4℃、12000rpm离心15min。
（4）将hibindrna结合柱置于2ml离心管中，每次转移不超过700ul的混合液至hibindrna结合柱内，室温、10000rpm离心1min。
（5）弃收集管内液体，1ml的80%乙醇加入离心柱柱内，在室温下7500rpm离心5min，弃收集管内液体。
（6）重复步骤（4），直到将所有混合液离心并结合到hibindrna结合柱上。
（7）将hibindrna结合柱放在一个新的2ml收集管中，加上300μlrnawashbufferi，室温、10000rpm离心1min，弃掉流出液。
（8）用500μlrnawashbufferii洗涤一次柱子，室温、10000rpm离心1min，弃流出液。
（9）重复步骤（8）一次，离心然后放在一个新的空收集管内，室温下以最大转速(≥12000rpm)离心2min，使的hibind基质完全干燥。
（10）rna的溶解：将离心柱放在一个新的1.5ml的收集管，沿着离心柱膜的中央加入15-30μl的rnasefreedh2o洗脱柱子。
5.样本rna质量控制
rna浓度测定：在分光光度计上选择rna档位，用100μldepc水调零，并选择适当的稀释浓度，记录测量所得数据（rna浓度，a260及a280的光密度值，a260/a280，a260/a230等），以便对实验可用rna质量进行监控。应多次测量，取平均值，od（a260/a280）值在1.8-2.0的患者可用于进行下一步实验；od值小于1.8说明提取物中存在有机物，od值大于2.0说明rna有降解。
6.总rna的完整性检测
1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总rna中的核糖体rna(rrna)，最大的两条条带28srna和18srna的亮度大致比为2:1时，说明rna的完整性较好，未出现降解。
7.mirna逆转录
第一链cdna的合成：逆转录反应体系见表5。在无rna酶的pcr管中依次加入表5中的各组分，样品充分混匀后，离心使液体至于管底，pcr仪中进行第一步反应，65℃5min，4℃降温，42℃60min，70℃15min，4℃保存。合成的第一条链cdna取出后，-20℃长期保存备用。
表5逆转录反应体系
8、q-pcr分析相关mirna的表达差异
u6基因做内参，进行pcr扩增检测模板质量，反应体系见表6。q-pcr反应检测仪为bio-rad公司的cfx96系统，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40次循环，72℃总延伸10min，溶解曲线在65~95℃之间。q-pcr采用相对定量法，基因表达分析软件为bio-radcfxmanager2.0，每一样品重复三次，利用2-△△ct方法进行分析。
表6q-pcr反应体系(10µl)
9、统计学分析
使用prism5.0统计软件进行分析并作图，两组间均数的比较使用t检验，计数资料的比较采用卡方检验。两组脑脊液mirnas的表达水平采用均数±标准差进行表示，两组数据进行f检验。用受试者工作特征曲线(roc)和曲线下的面积(auc)来分析mirna的诊断能力。建立logistic回归模型来预测5种mirna对乳腺癌脑转移联合诊断能力。
二、结果
乳腺癌脑转移组（48例）和对照组（68例）患者脑脊液标本中5条mirnas（mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c）中的差异表达。
1、各组mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c的相对表达量
组间差异比较发现，研究组脑脊液中5种肿瘤脑转移标志物水平显著高于对照组(p＜0.01)，研究组样本中mir-10b上调1-3倍，mir-200a上调3-5倍，mir-122上调2-5倍，mir-181c上调3-6倍，mir-21上调最为显著，上调10-15倍。方差齐性检验（f检验）及p值（见表3）。
表3两组脑脊液中5条mirnas的表达情况比较（x±s）
2、脑脊液中mirna组合的roc曲线分析
roc曲线分析中，roc曲线下面积越大，其诊断价值越大。auc为0.5时，即无诊断意义；auc在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；auc在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；auc＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
基于研究组和对照组脑脊液中mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-181c、mir-21的表达水平，（roc）曲线分析分别为：(a)mir-10b的曲线下面积（auc）为0.9332（标准误为0.02560，95%ci，0.8830-0.9834）；(b)mir-200a的auc为0.8454（标准误为0.03875，95%ci，0.7694-0.9214）；（c）mir-122的auc为0.8776（标准误为0.03535，95%ci，0.8083-0.9469）；（d）mir-21的auc为0.9152（标准误为0.02869，95%ci，0.8590-0.9714）；（e）mir-181c的auc为0.9648（标准误为0.014，95%ci，0.9360-0.9936）（见图1-5）。
在独立样品集中的进一步验证证明联合mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c用于诊断乳腺癌脑转移的准确度高达90％以上，具有较高的临床价值（见图6）。
三、结论
本发明的试剂盒进行检测乳腺癌脑转移时，首先检测mir-10b分子，然后再对其他mirna分子进行检测，上述检测乳腺癌是否出现脑转移患者的mirna表达差异情况分三种：（1）mir-10b分子，以及mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c分子中的一个或多个均阳性表达，此时说明患者出现脑转移；（2）mir-10b阴性表达，但是mir-200a、mir-122、mir-21、mir181c分子中的两个或两个以上均阳性表达，此时说明患者出现脑转移。（3）mir-10b、mir-200a、mir-122、mir-21、mir-181c分子均阴性表达，此时说明患者未出现脑转移，建议定期复查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
表1mirna序列
表2mirna的表达趋势及参考基因
表4mirnaqpcr引物序列