一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置、制备及检测方法与流程

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置、制备及检测方法。

背景技术：

淋球菌是临床比较常见的通过性传播的病原微生物，对人的感染力强。淋球菌主要引起泌尿生殖系统的化脓性感染，还会引起淋菌性眼炎，咽喉炎，直肠炎，盆腔炎等合并性或播散性感染。据估计，每年15-49岁人群中有7800万例淋病奈瑟菌新发病例。截至目前，由淋球菌引起的淋病既无有效的疫苗，治愈后也无持久的免疫力，作为一种传染性疾病一直危害着人类健康。在淋病的治疗上，淋球菌的耐药一直是淋病防治面临的一个重要问题。继淋球菌对青霉素、四环素和喹诺酮类药物的普遍耐药后，目前临床上主要以光谱头孢菌素，比如头孢曲松等作为治疗淋病的一线药物。

目前检测淋球菌耐药性的方法有琼脂稀释法，肉汤稀释法，e-test法，纸片扩散法，测淋球菌β-内酰胺酶，耐药基因检测探针等方法。琼脂稀释法是who的标准方法，该方法培养周期长，实验过程繁琐。纸片扩散法价格昂贵，重现性和定量性不足。耐药基因检测探针特异性强，灵敏度高，准确性好但是价格昂贵。上述方法需要专门的技术人员操作相对繁琐，不易推广。

因此，需要一种新型快速检测淋球菌mic和耐药性的方法以满足现代医学对淋球菌耐药性检测快速准确的需求。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置、制备及检测方法。本发明检测装置结构设计简洁、体积小巧，携带方便；检测装置制备方法简单，成本低；本发明的检测方法可同步进行定性实验与定量实验，不仅能够证明是否含有淋球菌且含有的淋球菌是否已经产生耐药；而且能够简便的测试出抗生素最小抑菌浓度，结果准确。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置，包括测试平台，测试平台包括基底层、测试层和加料层，测试层复合在基底层和加料层之间，加料层上开设加料孔，测试层上对应每个加料孔的位置设有测试区，测试区通过第一隔断结构与测试层上的空白位置隔离开来，每个测试区和相邻的其他测试区之间设有第二隔断结构，第一隔断结构和第二隔断结构内设有隔断物。

进一步地，第一隔断结构包括多个弧形隔断槽，多个弧形隔断槽围成面积略大于加料孔的圆形区域，第二隔断结构包括多个直条形隔断槽。

进一步地，测试层包括测试区域和对照区域，测试区域内布置测试孔，对照区域内布置对照孔；测试区域和对照区域之间设有第三隔断结构，第一隔断结构、第二隔断结构和第三隔断结构内均填充有隔断物，基底层、测试层和加料层通过隔断物复合在一起。

进一步地，还包括平台载体，测试平台置于平台载体中，两者配合使用。

作为优选，基底层、测试层和加料层均为硝酸纤维素薄膜制成的滤纸片。

作为优选，平台载体为能够容纳测试平台的容器，容器内壁及底面光滑透明。

本发明还提供了一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置的制备方法，该制备方法用于制备上述的装置，并包括以下步骤：

(1)设计基底层、测试层和加料层的形状与图案，并用打印机打印出所设计的形状与图案，切割，并在第一隔断结构、第二隔断结构和第三隔断结构的隔断槽内均填充隔断物；

(2)将测试平台用锡箔纸包好，对其进行加热，160℃加热3分钟，然后使用紫外灯照射正反面各30分钟；

(3)配置不同浓度梯度的抗生素标准溶液；

(4)按照顺时针在测试孔内分别滴加步骤(3)中的抗生素标准溶液；

(5)在对照孔中滴加对照溶液；

(6)干燥30-60min分钟。

进一步地，对照孔包括空白对照孔、阴性对照孔与阳性对照孔。设计空白、阴性、阳性对照孔，能够保证实验结果有效。

进一步地，在空白对照孔滴加缓冲液；在阴性对照孔中，滴加最高浓度的抗生素标准溶液，在对照孔中滴加的体积与测试孔中滴加的体积相同。

本发明还提供了一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的检测方法，该检测方法采用上述制备方法制备得到的装置，并包括以下步骤：

1)配置淋球菌悬液；

2)将测试平台置于平台载体中，待测试平台湿润后，再顺时针分别在测试孔中滴加淋球菌悬液，在阳性对照孔与阴性对照孔也分别加入等体积的淋球菌悬液；

3)将培养皿置于37℃环境中，培养12-18小时，然后将培养皿置于室温，分别顺时针在所有测试孔与对照孔中滴加等体积的显色底物，2分钟后，拍照，将所得照片与比色软件对比得到所对应的抗生素浓度。

进一步地，抗生素为头孢曲松。

进一步地，步骤2)中显色底物为二盐酸四甲基对苯二胺tmpd。

本发明的有益效果是：

(1)本发明检测装置结构设计合理、体积小巧，方便携带；而且不需要专业技术人员操作，操作简便，成本低，能够帮助临床诊断出耐药的淋球菌株。

(2)本发明检测装置中隔断结构的设置可以将各部分隔离成单独的区域，相互之间不干扰，保证实验结果准确、可靠。

(3)本发明检测装置的制备方法简单，成本低。

(4)本发明的检测方法简单快速，特异性强、灵敏度高、重复性好，能够同时对特定淋球菌株进行多种抗生素最小抑菌浓度检测。根据抗生素的最小抑菌浓度mic还可以帮助判断不同株淋球菌对特定抗生素的耐药与否。

(5)本发明的检测方法可同步进行定性实验与定量实验，不仅能够证明是否含有淋球菌且含有的淋球菌是否已经产生耐药；而且能够很好地替代临床上比较贵的e-test试纸，能够简便的测试出抗生素最小抑菌浓度，结果准确。

(6)本发明根据显色底物tmpd与存活的淋球菌的显色特性进行测定，颜色的深浅证明淋球菌的存活数量的多少，通过imagej软件对颜色深浅进行客观判断，结果直观清晰，可靠性强。

附图说明：

图1是本发明检测装置的加料层的俯视图。

图2是本发明检测装置的测试层的俯视图。

图3是图2的e-e方向的剖视图。

图4为本发明检测装置的测试平台载体结构示意图。

图5为本发明的检测结果图；其中，纵坐标表示：显色底物tmpd与存活的淋球菌形成的蓝色组分的含量，横坐标表示：不同的抗生素浓度，a表示抗生素浓度为0.125μg/ml；b表示抗生素浓度为0.25μg/ml；c表示抗生素浓度为0.5μg/ml；d表示抗生素浓度为1μg/ml；e表示negativecontrol，阴性对照孔中抗生素浓度为1μg/ml；f表示positivecontrol，阳性对照孔中抗生素浓度为0μg/ml；ns表示nosignificantdifference，差异不显著，***表示差异非常显著(p<0.001，p值即概率，反映某一事件发生的可能性大小；统计学根据显著性检验方法得到p值，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.001)。

图中标号：基底层1，测试层2，加料层3，加料孔4，第一隔断结构5，第二隔断结构6，测试孔7，对照孔8，第三隔断结构9。

具体实施方式

以下是对本发明的技术方案作进一步详细说明。应当指出的是，实施例只是对本发明的具体描述，而不应视为对本发明的限定。

实施例1

一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置，包括测试平台，如图3所示，测试平台包括基底层1、测试层2和加料层3，测试层2复合在基底层1和加料层3之间，加料层3上开设加料孔4，测试层2上对应每个加料孔4的位置设有测试区，测试区通过第一隔断结构5与测试层上的空白位置隔离开来，每个测试区和相邻的其他测试区之间设有第二隔断结构6，如图2所示；第一隔断结构5和第二隔断结构6内设有隔断物，如图3所示。

隔断结构的设置可以将各部分隔离成单独的区域，相互之间不干扰，保证实验结果准确、可靠。

作为一种优选的方式，如图2所示，第一隔断结构5包括多个弧形隔断槽，多个弧形隔断槽围成面积略大于加料孔的圆形区域，第二隔断结构6包括多个直条形隔断槽。

作为一种优选的方式，测试层2包括测试区域和对照区域，测试区域内布置测试孔7，对照区域内布置对照孔8；测试区域和对照区域之间设有第三隔断结构9；第三隔断结构9也包括多个弧形隔断槽；第一隔断结构5、第二隔断结构6和第三隔断结构9内均填充有隔断物；基底层1、测试层2和加料层3通过隔断物复合在一起。

可以对每个测试孔7和对照孔8进行编号标记来区别。

作为一种优选的方式，隔断物为蜡或者硅胶，加热时变成熔融状态，冷却时凝固，而且不透水，既可以起到隔断的作用，又可以将三层结构复合起来。

本实施例中，隔断物为蜡。

本实施例中，测试孔7为9个，对照孔8为3个，对照孔8设置在中部，测试孔7围绕对照孔设置，便于对比观察，设计合理紧凑，充分利用空间，节省材料。

本实施例中，还包括平台载体，测试平台置于平台载体中，两者配合使用。

进一步地，平台载体为能够容纳测试平台的容器，容器内壁及底面光滑透明。

本实施例中，平台载体为培养皿。

本实施例中，基底层、测试层和加料层均为硝酸纤维素薄膜制成的滤纸片。

实施例2

本发明还提供了一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的装置的制备方法，该制备方法用于制备上述的装置，并包括以下步骤：

(1)用coreldraw绘制设计基底层、测试层和加料层的形状与图案，并用打印机打印出所设计的形状与图案，切割，并在第一隔断结构、第二隔断结构和第三隔断结构的隔断槽内均填充隔断物；

(2)将测试平台用锡箔纸包好，置于加热板上，160℃加热3分钟，待蜡融化后置于紫外灯下，照射正反面各30分钟；

(3)配置不同浓度梯度的头孢曲松标准溶液；头孢曲松标准溶液的浓度分别为：1μg/ml,0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.125μg/ml，0.064μg/ml，0.032μg/ml，0.016μg/ml，0.008μg/ml和0.004μg/ml；

(4)按照顺时针在测试孔内分别滴加2.5μl的步骤(3)中的头孢曲松标准溶液；

(5)在对照孔中滴加对照溶液；

(6)干燥30-60min分钟。

进一步地，对照孔包括空白对照孔、阴性对照孔与阳性对照孔。设计空白、阴性、阳性对照孔，能够保证实验结果有效。

本实施例中，在空白对照孔滴加2.5μl的pbs缓冲液；在阴性对照孔中，滴加2.5μl浓度为1μg/ml的头孢曲松标准溶液。

实施例3

本发明还提供了一种快速检测淋球菌最小抑菌浓度的检测方法，该检测方法采用上述制备方法制备得到的装置，并包括以下步骤：

1)配置淋球菌悬液；

①用取菌环刮取适量淋球菌，此淋球菌购买自美国模式菌种保藏中心atcc，保藏号为atcc49226；

②将淋球菌置于1.5ml离心管中，加入1mlpbs缓冲液混匀待检。

③用移液枪分别取200ul步骤②得到的淋球菌悬液和pbs缓冲液于96孔板中，用分光光度计测定两者的光密度值，稀释淋球菌悬液至其浓度为10^-8cfu/ml；

2)将测试平台置于培养皿中，培养皿中盛有gc琼脂，待测试平台湿润后，顺时针分别在测试孔中滴加浓度为10^-8cfu/ml的淋球菌悬液2μl，在阳性对照孔和阴性对照孔也分别加入浓度为10^-8cfu/ml的淋球菌悬液2μl；

3)将培养皿置于37℃环境中，培养12-18小时，然后将培养皿置于室温，分别顺时针在所有测试孔与对照孔中滴加相同体积的显色底物，本实施例中滴加的体积为2μl，2分钟后，拍照，将所得照片与比色软件对比得到所对应的抗生素浓度。

进一步地，步骤3)中显色底物为二盐酸四甲基对苯二胺tmpd，质量百分比浓度为1％。

检测结果

显色底物tmpd可使存活的淋球菌显蓝色，存活的淋球菌越少，蓝色越浅，颜色梯度骤降的就是淋球菌对于该抗生素的最小抑菌浓度mic。

基于照相设备拍摄的各个孔滴加tmpd显色底物后不同显色程度的照片，利用imagej软件计算淋球菌与tmpd作用显色后各个小孔内的平均灰度值，得到不同浓度抗生素对应的平均灰度值，制成不同灰度梯度比色软件，根据比色软件比色得出相对应的抗生素浓度。

图5是确定mic在0.25μg/ml和0.5μg/ml之间的检测结果图。抗生素浓度为0.25μg/ml的实验结果和阴性对照实验结果差异非常显著，抗生素浓度为0.5μg/ml的实验结果和阴性对照实验结果差异不显著，因此，0.25μg/ml是淋球菌对头孢曲松的最小抑菌浓度mic，测试结果和常规的e-test试验结果基本一致，可以替代昂贵的e-test试纸，该方法能够利用到临床初步检测。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。