一种快速激活淋巴因子激活杀伤细胞LAK的方法与流程

本发明属于生物领域，涉及一种快速激活淋巴因子激活杀伤细胞lak的方法。
背景技术：
免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国fda批准世界上第一个细胞免疫治疗产品provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。淋巴因子激活杀伤细胞(lak)是在20世纪80年代由rosenberg等研发的，其实质是il-2激活的具有杀瘤活性的nk和t细胞。1984年11月rosenberg研究组经美国fda批准，首次将lak细胞用于临床治疗。该疗法对转移性肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌和非霍奇金淋巴瘤患者的疗效较显著。但lak杀伤力不强，临床应用需要大量输注。而且其扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用il-2，从而导致明显的毒副作用，最常见和最严重的毒副作用是毛细血管渗漏综合征，主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。目前，lak细胞要经过体外培养至少3～7天，流程长，费用昂贵，易污染，使临床应用受到限制，故致力于简便快捷诱导培养的研究从未停止过。技术实现要素：本发明旨在克服现有技术不足，提供一种快速激活淋巴因子激活杀伤细胞lak的方法。本发明技术方案如下：一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方法，在培养基中添加ril-2，在培养基中还添加激活剂酶解多肽a。优选地，所述的快速激活方法具体步骤为：将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽a以及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养24h；酶解多肽a的制备方法为：将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶+中性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，离心，上清冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用超纯水溶解，然后依次用截留分子量为10000u、7000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得10000u～7000u组分冷冻干燥得到酶解多肽a。优选地，酶解条件为：经木瓜蛋白酶(酶活力为80万u/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万u/g)在复合配比3:1、ph为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/l、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解时间8h的条件下酶解。优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液。优选地，离心条件为：9000rpm离心25min。优选地，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法从脐血中分离脐血单个核细胞。优选地，脐血采集方法为：采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集；采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理备用。一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活培养基，在含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中添加终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽a以及500iu/ml的ril-2。上述培养基在淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方面的应用。一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方法，在培养基中添加ril-2，在培养基中还添加激活剂酶解多肽c。优选地，所述的快速激活方法具体步骤为：将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽c以及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养24h；酶解多肽c的制备方法为：将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶+中性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，离心，上清冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得5000u～3000u组分冷冻干燥得到酶解多肽c。优选地，酶解条件为：经木瓜蛋白酶(酶活力为80万u/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万u/g)在复合配比3:1、ph为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/l、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解时间8h的条件下酶解。优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液。优选地，离心条件为：9000rpm离心25min。优选地，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法从脐血中分离脐血单个核细胞。优选地，脐血采集方法为：采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集；采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理备用。一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活培养基，在含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中添加终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽c以及500iu/ml的ril-2。上述培养基在淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方面的应用。一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方法，在培养基中添加ril-2，在培养基中还添加激活剂酶解多肽d。优选地，所述的快速激活方法具体步骤为：将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽d以及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养24h；酶解多肽d的制备方法为：将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶+中性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，离心，上清冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用超纯水溶解，然后依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得3000u～1000u组分冷冻干燥得到酶解多肽d。优选地，酶解条件为：经木瓜蛋白酶(酶活力为80万u/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万u/g)在复合配比3:1、ph为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/l、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解时间8h的条件下酶解。优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液。优选地，离心条件为：9000rpm离心25min。优选地，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法从脐血中分离脐血单个核细胞。优选地，脐血采集方法为：采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集；采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理备用。一种淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活培养基，在含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中添加终浓度为40-60μg/ml的酶解多肽d以及500iu/ml的ril-2。上述培养基在淋巴因子激活杀伤细胞lak的快速激活方面的应用。有益效果：本发明快速激活方法在不大量使用ril-2的前提下，通过在培养基中添加酶解多肽a、酶解多肽c或酶解多肽d，仅使用24h即实现lak细胞快速激活。附图说明图1为各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤率(％)。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实施例1：多肽的制备1、小麦胚芽脱脂将小麦胚芽脱脂后使用，或者直接购买脱脂小麦胚芽进行后续实验。脱脂条件：提取剂：石油醚(60℃～90℃)，水浴温度：65℃，料液比：1:8(g/ml)，脱脂时间：4h。脱脂小麦胚芽粉碎成80目得到脱脂的小麦胚芽粉，备用。2、多肽的水解与纯化将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶(酶活力为80万u/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万u/g)在复合配比3:1(质量比)、ph为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/l、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解时间8h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，9000rpm离心25min，上清冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10ml超纯水)，然后依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)得到酶解多肽a(10000u～7000u)、酶解多肽b(7000u～5000u)、酶解多肽c(5000u～3000u)、酶解多肽d(3000u～1000u)。超滤过程中控制co2的压力使其小于0.25mpa。将酶解多肽a、酶解多肽b、酶解多肽c、酶解多肽d于4℃干燥保存，备用。实施例2：lak细胞快速激活方法一、实验材料rpmi1640培养基、10％胎牛血清购自gibco公司。ril-2购自北京四环生物制药公司。二、实验方法1、脐血采集及单个核细胞分离采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血100例，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖(cpda)抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集。采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理。参考本领域技术手册(沈关心等，现代免疫学实验技术，湖北科学技术出版社，1998，172-175页)，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。2、lak细胞的快速激活常规激活：将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养72h。快速激活：将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为50μg/ml的酶解多肽a、b、c或d及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件培养24h。3、对肿瘤细胞杀伤力检测人胃癌细胞株mgc-803为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基置于37℃、5％co2培养箱内传代培养，取对数期进行后续实验。取各组激活的lak细胞作为效应细胞，以mgc-803胃癌细胞为靶细胞，按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设单独靶细胞和单独效应细胞组，每组设3个复孔，放置37℃、5％co2孵箱中培养24h后，每孔加mtt(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜150μl，振荡溶解10min后，用酶标仪570nm测吸光值a，按如下公式计算各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤活性。杀伤率(％)＝[1-(实验组a值-单独效应细胞a值)/单独靶细胞a值]×100％4、统计学处理数据采用均值±标准偏差表示，用spss17.0统计软件行t检验，p<0.05具有统计学意义。三、实验结果各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤率如表1和图1所示。该实验结果表明，本发明快速激活方法在不大量使用ril-2的前提下，仅使用24h即实现lak细胞快速激活。表1各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤率组别杀伤率(％)常规激活17.4±5.1酶解多肽a45.7±6.2酶解多肽b19.8±5.7酶解多肽c48.5±6.4酶解多肽d43.1±6.0实施例3：lak细胞快速激活方法一、实验材料rpmi1640培养基、10％胎牛血清购自gibco公司。ril-2购自北京四环生物制药公司。二、实验方法1、脐血采集及单个核细胞分离采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血100例，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖(cpda)抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集。采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理。参考本领域技术手册(沈关心等，现代免疫学实验技术，湖北科学技术出版社，1998，172-175页)，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。2、lak细胞的快速激活将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40μg/ml的酶解多肽a、c、d以及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养24h。3、对肿瘤细胞杀伤力检测人胃癌细胞株mgc-803为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基置于37℃、5％co2培养箱内传代培养，取对数期进行后续实验。取各组激活的lak细胞作为效应细胞，以mgc-803胃癌细胞为靶细胞，按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设单独靶细胞和单独效应细胞组，每组设3个复孔，放置37℃、5％co2孵箱中培养24h后，每孔加mtt(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜150μl，振荡溶解10min后，用酶标仪570nm测吸光值a，按如下公式计算各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤活性。杀伤率(％)＝[1-(实验组a值-单独效应细胞a值)/单独靶细胞a值]×100％4、统计学处理数据采用均值±标准偏差表示，用spss17.0统计软件行t检验，p<0.05具有统计学意义。三、实验结果实验结果表明，酶解多肽a、c、d终浓度为40μg/ml时，快速激活24h的lak细胞对mgc-803胃癌细胞的杀伤率分别为(35.3±5.5)％、(39.5±5.9)％、(33.8±5.3)％。实施例4：lak细胞快速激活方法一、实验材料rpmi1640培养基、10％胎牛血清购自gibco公司。ril-2购自北京四环生物制药公司。二、实验方法1、脐血采集及单个核细胞分离采用密闭式收集法采集足月顺产健康新生儿脐血100例，而且产前检查其父母均无遗传性疾病家族史，采用柠檬酸-磷酸-葡萄糖(cpda)抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集。采集后4℃冰箱保存，24h内进行分离和冻存处理。参考本领域技术手册(沈关心等，现代免疫学实验技术，湖北科学技术出版社，1998，172-175页)，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。2、lak细胞的快速激活将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基(10％fcs-rpmi1640)调制至2×106/ml，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为60μg/ml的酶解多肽a、c、d以及500iu/ml的ril-2，置于37℃、5％co2条件下培养24h。3、对肿瘤细胞杀伤力检测人胃癌细胞株mgc-803为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基置于37℃、5％co2培养箱内传代培养，取对数期进行后续实验。取各组激活的lak细胞作为效应细胞，以mgc-803胃癌细胞为靶细胞，按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设单独靶细胞和单独效应细胞组，每组设3个复孔，放置37℃、5％co2孵箱中培养24h后，每孔加mtt(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜150μl，振荡溶解10min后，用酶标仪570nm测吸光值a，按如下公式计算各组lak细胞对胃癌细胞的杀伤活性。杀伤率(％)＝[1-(实验组a值-单独效应细胞a值)/单独靶细胞a值]×100％4、统计学处理数据采用均值±标准偏差表示，用spss17.0统计软件行t检验，p<0.05具有统计学意义。三、实验结果实验结果表明，酶解多肽a、c、d终浓度为60μg/ml时，快速激活24h的lak细胞对mgc-803胃癌细胞的杀伤率分别为(50.7±5.8)％、(55.2±6.1)％、(48.9±5.7)％。实施例5：lak细胞快速激活培养基一种lak细胞快速激活培养基，在含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中添加终浓度40-60μg/ml的酶解多肽a、酶解多肽c或酶解多肽d及500iu/ml的ril-2。酶解多肽a、酶解多肽c或酶解多肽d的制备方法为：将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶(酶活力为80万u/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万u/g)在复合配比3:1(质量比)、ph为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/l、加酶量5％、酶解时间8h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10ml超纯水)，然后依次用截留分子量为10000u、7000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)得到酶解多肽a(10000u～7000u)、酶解多肽c(5000u～3000u)、酶解多肽d(3000u～1000u)。本发明快速激活方法在不大量使用ril-2的前提下，通过在培养基中添加酶解多肽a、酶解多肽c或酶解多肽d，仅使用24h即实现lak细胞快速激活。上述实施例旨在具体介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12