蔗渣固定化棘孢曲霉及其在喹诺酮类抗生素污染修复中的应用的制作方法

本发明涉及蔗渣固定化棘孢曲霉及其在喹诺酮类抗生素污染修复中的应用，特别是在水体和土壤中的环丙沙星、诺氟沙星污染修复中的应用，属于固定化微生物生态修复技术领域。

【背景技术】

喹诺酮类抗生素是一种人工合成的人畜通用抗菌剂，属于吡酮酸衍生物。有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，对多种耐药菌有较好的疗效，常被用作青霉素及头孢菌素替代药物治疗感染，在治疗人和动物细菌性感染疾病具有良好的效果，被广泛应用于动物疾病的治疗和预防，常作为畜禽饲料添加药物添加到动物饲料中。目前国内外使用较多的是第三代喹诺酮，又称氟喹诺酮fluorquinolones(fqs)，其代表有环丙沙星(cip)、诺氟沙星(nor)、左氧氟沙星(lev)、恩诺沙星等(enr)、加替沙星(gat)。

调查显示，2013年我国抗生素总使用量约为16.2万吨，其中氟喹诺酮使用量为25500吨，其使用量较大，并呈增长态势。喹诺酮类抗生素在动物体内代谢率较低，大多以原药或者其他代谢形式随粪便、尿液直接排到体外环境中，畜禽的排泄物是环境喹诺酮类抗生素污染的其中一个主要来源，排出后的喹诺酮类抗生素仍具有较高的生物活性。有研究对广东省20个规模化猪牛养殖场粪便进行检测分析，4种喹诺酮类抗生素和4种磺胺类抗生素均被检出，前者鲜重总含量在24.5～1516.2μg/kg之间，平均为581.0μg/kg，以环丙沙星和恩诺沙星为主。喹诺酮类抗生素在水中溶解度较低，且易与土壤中ca²⁺、mg²⁺等金属阳离子结合成稳定络合物，容易被土壤吸附而保留，环境中喹诺酮类抗生素的主要归趋为土壤。有研究对北京东南郊86个土壤样品中的氟喹诺酮类抗生素的含量进行统计分析，发现土壤样品中5种氟喹诺酮类抗生素总含量的平均值为46.1μg/kg。在避光自然条件下，氟喹诺酮类抗生素非常稳定，不易降解，其中环丙沙星的半衰期在一年以上，为462.1d，为持久污染物。未经处理的畜禽粪便作为有机肥直接施用于农田，具有持久性的喹诺酮类抗生素经雨水淋洗进入地表水和地下水中，于土壤中不断积累，致使土壤喹诺酮类抗生素污染加剧，对生态环境的稳定和生物体的健康造成威胁。土壤中的喹诺酮类抗生素可由植物富集、经食物链传递。近年来，喹诺酮类抗生素不仅在土壤、水体中检出，在蔬菜、肉蛋中检出的报导亦越来越多。有研究对珠三角地区蔬菜基地土壤中的抗生素进行检测分析发现，珠三角多市检出的有机蔬菜基地中喹诺酮类抗生素平均浓度为122.25μg/kg。从广州市超市采集来自广东、山东等地的各种蔬菜样品41份中检测发现，喹诺酮类抗生素的检出率在93％以上，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的最高含量分别为148.92、108.11和85.19μg/kg。作为新型环境污染物，其污染修复技术受到了广泛关注。

喹诺酮类抗生素污染可以通过物理、化学或生物的方法来处理。物理方法工程量大，去除效果有限，包括物理吸附法、膜处理法等；去除难降解有机物时，化学法表现出良好效果，化学法包括光催化降解法、水解、电化学氧化法等，但化学方法添加的反应物或化学作用下产生的中间产物可能具有更强的毒性、更难降解；生物降解是去除环境污染物的一种有效的方式，包括活化污泥法、生物曝气法等。合适的微生物能利用目标污染物，通过一系列作用来使目标物代谢为二氧化碳和水等，该法安全、成本低且无二次污染，已引起国内外学者的广泛关注。

现有方法更多是关注喹诺酮类抗生素污染水体的修复，对土壤中喹诺酮类抗生素研究较少，或对土壤喹诺酮类抗生素处理效果不佳。很多研究所处理的抗生素浓度较低，与近年来喹诺酮类抗生素的检出浓度差距较大。

固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将分散游离的微生物固定在限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。载体材料能提供的有利微环境作为缓冲体系，屏蔽土著微生物的竞争作用和不利外界条件的侵害，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长；同时固定化载体作为吸附剂还可以有效地富集水体或土壤中的喹诺酮类抗生素，提高其在载体上的生物有效浓度；微生物及其分泌的胞外酶也被富集固定在载体上，增加了与胞外抗生素的接触效率，实现高效降解菌有效修复抗生素污染。

目前用作微生物固定化的载体多为成本较高、生物亲和性不高的有机载体，如戊二醛、海藻酸钙、海藻酸钠、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺凝胶等。农业废弃物(如蔗渣、花生壳和秸秆等)作为微生物固定化的载体，对生长在其表面和孔隙中的微生物有很强的亲和性；还可吸附富集土壤中的喹诺酮类抗生素污染物，提高固定在其表面和孔隙的高效降解微生物降解喹诺酮类抗生素的效率；农业废弃物含有丰富的营养元素，使用过程中可以自然降解，降解后的有机质能改善土壤理化性质，所以用后的处理简单环保，不会造成二次污染，且价格低廉。

技术实现要素：

本发明目的是为了克服现有技术的不足，提供一种能处理水体和土壤中喹诺酮类抗生素污染的蔗渣固定化棘孢曲霉，并提供一种菌密度大、反应速度快、耐环境冲击的固定化微生物方法处理水体和土壤中高残留、难降解的喹诺酮类抗生素环丙沙星、诺氟沙星，适用于修复水体和土壤中喹诺酮类抗生素污染。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

蔗渣固定化棘孢曲霉，其特征在于采用蔗渣为固定化载体固定降解菌棘孢曲霉aspergillus-438。

本发明中的蔗渣预先干燥，接种前再经过无机盐培养液预处理，菌悬液加无机盐培养液的混合液与蔗渣的用量比为10ml:1g。

本发明中的棘孢曲霉菌株aspergillus-438在固定化于蔗渣载体前预先经过培养制备成菌悬液，所述的菌悬液与干燥蔗渣的用量比为0.2～5ml︰1g。

本发明中的棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液通过以下步骤培养制备而得：

将纯化后的细菌接种于试管中的固体筛选培养基上，28℃活化2天，将试管中的菌株用生理盐水冲洗并接种于体积为50ml液体筛选培养基的锥形瓶中，于28℃，150r/min的摇床上涡旋振荡培养至对数生长期，置于4℃冰箱备用。

本发明中蔗渣载体上固定化棘孢曲霉aspergillus-438的步骤为：

a、将蔗渣洗净烘干、打碎，加入锥形瓶，高压蒸汽灭菌处理30min，冷却；

b、向锥形瓶加入无菌处理的无机盐培养液，紫外灭菌40min；

c、接种培养至对数生长期的棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液，混匀密封，于28℃，转速为150r/min的摇床内振荡培养至微生物生物量最大即得蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438。

一种蔗渣固定化棘孢曲霉在喹诺酮类抗生素污染修复中的应用。

本发明蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438在水中喹诺酮类抗生素环丙沙星的污染修复中，蔗渣固定化细菌的用量为：干燥蔗渣载体与棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液的用量比为1g：2.5-4.5ml，优选1g：3.5ml，可治理蔗渣40倍质量的环丙沙星污染水。处理时按照该比例混合，在32-43℃、150r/min下震荡处理。

本发明蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438在土壤中喹诺酮类抗生素环丙沙星的污染修复中，蔗渣固定化细菌的用量为：干燥蔗渣载体与棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液的比例为1g：0.2-2ml，优选1g：1ml，可处理干燥蔗渣10倍重量的环丙沙星污染土壤。处理时按照该比例混合均匀，在28℃～43℃下培养，保持土壤有一定的湿度，含水量40％-60％，以保证细菌生长。

本发明蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438在水中喹诺酮类抗生素诺氟沙星的污染修复中，蔗渣固定化细菌的用量为：干燥蔗渣载体与棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液的用量比为1g：3-5ml，优选1g：4ml，可治理蔗渣40倍质量的诺氟沙星污染水。处理时按照该比例混合，在37℃、150r/min下震荡处理。

本发明蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438在土壤中喹诺酮类抗生素诺氟沙星的污染修复中，蔗渣固定化细菌的用量为：干燥蔗渣载体1g，接种0.5-1.5ml棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液，优选干燥载体1g，接种1ml棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液，可处理干燥蔗渣10倍重量的环丙沙星污染土壤。处理时按照该比例混合均匀，在28℃～43℃下培养，保持土壤有一定的湿度，含水量40％-60％，以保证细菌生长。

与现有技术相比，本发明有如下优点：

固定化载体使用生物质材料蔗渣，蔗渣为农业废料成本低，获取容易，用于环境原位修复时可自然降解，环保无二次污染；固定化操作简便，固定化微生物使用方便，可大量制备推广；在处理水体和土壤中环丙沙星的污染均能达到较好的处理效果，该技术能降低喹诺酮类抗生素在环境中富集的风险，避免喹诺酮类抗生素污染通过食物链传递，对生态环境和人类健康有着十分重要的意义。

本发明通过特定培养基筛选、驯化出对环丙沙星、诺氟沙星有高效降解作用的特定降解菌棘孢曲霉aspergillus-438，并采用甘蔗渣为固定化载体，固定化构建高效稳定的农业废料固定化微生物体系。该方法固定化微生物具有细菌密度大、反应速度快和耐环境冲击等特点，且作为载体廉价环保、无二次污染，在水体和土壤中喹诺酮类抗生素污染修复中具有很大的应用潜力，对保护生态环境、农业生产、人体健康有积极意义。

【附图说明】

图1为本发明中的棘孢曲霉aspergillus-438的扫描电镜图；

图2为本发明中的棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液的微生物生长曲线图(od600nm)；

图3为本发明蔗渣固定化aspergillus-438在处理污水时环丙沙星的降解效果图；

图4为不同温度对蔗渣固定化aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤的影响；

图5为重金属离子对蔗渣固定化aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤的影响；

图6为不同接菌量对蔗渣固定化aspergillus-438处理诺氟沙星污染土壤的影响。

【具体实施方式】

本发明蔗渣固定化棘孢曲霉的方法包括如下步骤：

1.通过富集培养、分离纯化和驯化获得能以环丙沙星为唯一碳源进行生长的棘孢曲霉aspergillus-438菌；

2.将纯化后的棘孢曲霉aspergillus-438菌接种于试管中固体筛选培养基的斜面上活化两天至菌落生长达到饱和，将斜面的菌株接种于50ml液体筛选培养基中，于28℃震荡培养箱中以150r/min摇匀培养两天制得菌悬液，于4℃冰箱备用；

3.将干燥打碎的蔗渣称取适量加入锥形瓶，高压蒸汽灭菌处理，冷却，向锥形瓶加入无菌处理的无机盐培养液，紫外灭菌，然后接种棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液，混匀密封，于28℃，转速为150r/min的摇床内振荡培养至微生物生物量最大即可；

其中菌悬液加无机盐培养液的混合液与蔗渣的用量比为10ml：1g，菌悬液与干燥蔗渣的用量比为0.2～5ml︰1g，无机盐培养液补足即可。

下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细说明：

蔗渣固定化棘孢曲霉的步骤如下：

i、降解菌棘孢曲霉aspergillus-438的筛选、分离、驯化

实验所需培养基如下：

微量元素溶液(1000ml)：feso40.1g，mnso40.1g，znso40.1g，na2moo40.01g，cacl20.1g，cuso40.1g，蒸馏水1000ml。

无机盐培养液(1000ml)：k2hpo40.5g，kh2po40.5g，nacl0.2g，mgso40.2g，nh4no31.0g，微量元素溶液10ml，蒸馏水l000ml，ph＝7.5；

液体筛选培养基(1000ml)：k2hpo40.5g，kh2po40.5g，nacl0.2g，mgso40.2g，nh4no31.0g，微量元素溶液10ml，蒸馏水l000ml，环丙沙星按模拟污染物需求添加，ph＝7.5；环丙沙星为唯一碳源的无机盐培养液

固体筛选培养基需在液体筛选培养基中加20～25g琼脂；

取自广州某猪场的新鲜猪粪、规模化养殖场取样土壤各5g，无菌水95ml，置于250ml锥形瓶中，加入适量玻璃珠，于28℃，150r/min的摇床上振荡20min，得到含菌原液。取1ml该原液，用涂布棒均匀涂布在以环丙沙星为唯一碳源，污染浓度为50mg/l的固体筛选培养基上；28℃条件下培养3天，定时观察培养基上菌落生长情况。仔细挑出培养基上菌落，采用平板划线法对挑选出得菌体进行分离，得到纯化的单一菌落。以环丙沙星为唯一碳源，按照污染浓度为50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l的固体筛选培养基依次转接，每个浓度转接3次，最后得到驯化的耐受降解菌。用生理盐水将分离出的纯化菌分别冲洗下来，接种至污染浓度为50mg/l的液体筛选培养基上，在28℃、150r/min的摇床上振荡，用高效液相色谱监测24小时内剩余的环丙沙星含量，检测环丙沙星的降解效果，选取降解效率最高的菌株，将其转接至环丙沙星浓度为250mg/l的斜面固体筛选培养基上，4℃保存备用，进行后续实验。

所得的降解菌棘孢曲霉aspergillus-438在固体筛选培养基上培养3天，观察其菌落形态：初始时为浅黄色至土黄色，成熟后为黑色颗粒，质地略呈絮状，紧密散布于整个平板中。在扫描电镜下观察(如图1所示)可见aspergillus-438为椭圆不规则形，壁表面不光滑，有较多短刺。其生物学特性为：过氧化氢酶实验呈阳性，为好氧动力菌；甲基红实验呈阳性；产吲哚实验呈阳性；淀粉水解实验呈阳性。菌株的生理生化特性依据《临床常见细菌真菌鉴定手册》进行。将aspergillus-438的核苷酸序列鉴定结果与ncbi数据库中已知菌种序列进行同源相似性对比，其序列与棘孢曲霉属(aspergillusaculeatus)同源相似度达100％。

ii、制备棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液

将步聚i获得的棘孢曲霉aspergillus-438菌接种于试管中固体筛选培养基的斜面上活化2天，将斜面的菌株接种于50ml液体筛选培养基，于28℃、150r/min的摇床上涡旋振荡培养至对数生长期，大约需要60～64小时(棘孢曲霉aspergillus-438的生长曲线如图2所示)，离心后取上清液倒出，制成菌悬液置于4℃冰箱备用。

iii、蔗渣固定化降解菌棘孢曲霉aspergillus-438

蔗渣洗净烘干，剪成段状，用粉碎机适度打碎，称取适量加入锥形瓶，1.5mpa高压蒸汽灭菌处理30min，向锥形瓶加无菌处理的无机盐培养液，紫外灭菌紫外灯下灭菌40min，待冷却，菌悬液加无机盐培养液的混合液与蔗渣的用量比为10ml：1g；在处理过的蔗渣上接种培养至对数生长期的棘孢曲霉aspergillus-438菌悬液，混匀密封，于28℃，转速为150r/min的摇床内振荡培养至微生物生物量最大即得蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438；达到微生物生物量最大需要培养2～3天。菌悬液与干燥蔗渣的用量比为0.2～5ml︰1g，应用到土壤中诺氟沙星的处理优选菌悬液与干燥蔗渣的用量比为1ml︰1g，应用到污水中环丙沙星的处理优选菌悬液与干燥蔗渣的用量比为3.5ml︰1g。

应用例1：蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438处理环丙沙星污水

实验设置3种处理：固定化微生物实验组(固定化aspergillus-438+环丙沙星污水)；游离微生物对照组(aspergillus-438菌悬液+环丙沙星污水)；空白对照组(环丙沙星污水)。

按菌悬液与干燥蔗渣的用量比为3.5ml︰1g制备3组蔗渣固定化aspergillus-438，与平行培养的游离微生物及空白对照组对照实验。

制备模拟环丙沙星污水，每个锥形瓶分别加入100ml污染浓度为100mg/l的环丙沙星液体筛选培养基，密封包好。在28℃，150r/min摇床内振荡培养96小时，用高效液相色谱取样检测。结果如图3所示，可以看出，96小时内空白对照组和游离对照组无明显降解，12h内蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438对污水中的环丙沙星去除率达51.74％，说明固定化微生物对环丙沙星污水的去除效果明显优于游离微生物。

应用例2：蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤

2.1试验用土取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质赤红壤，土壤ph(水/土＝2/1)为5.25，有机质为7.89g/kg，氮、磷、钾为别0.71、0.72、2.61g/kg。未检出环丙沙星，过2mm筛后待用。将100mg环丙沙星用稀氨水溶解，加至50g土壤中，搅拌混合均匀，室内风干后再与950g土壤混合均匀，即得污染浓度为100mg/kg的人工模拟土壤，暗箱保存待用。

2.2不同温度对蔗渣固定化aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤的影响。

试验设置以下3种处理：空白对照组(不加菌的环丙沙星污染土)；游离微生物对照组(aspergillus-438菌悬液+环丙沙星污染土)；5种不同温度下的固定化微生物实验组(固定化aspergillus-438+环丙沙星污染土)。0d起，每5d抽提取样，共观察30d，每种处理设3个平行。

按菌悬液与干燥蔗渣的用量比为3.5ml︰1g制备3组蔗渣固定化aspergillus-438，与平行培养的游离微生物及空白对照组对照实验。

向烧杯中加入10g的环丙沙星污染土，搅拌均匀，将固定化棘孢曲霉aspergillus-438实验组组分别放入23℃、28℃、33℃、38℃、43℃的生化培养箱中培养，游离微生物及空白对照组置于28℃培养，实验中保持土壤有一定的水分以保证微生物生长。分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样抽提，用高效液相色谱法测定环丙沙星的残留量并计算其降解率。

由图4可见，固定化微生物组中23℃、28℃、33℃、38℃、43℃环丙沙星的降解率分别为28.32％、35.46％、41.39％、46.03％、58.24％。相比空白对照处理、游离微生物处理中环丙沙星的降解率分别为：2.89％、1.94％，固定化细菌处理环丙沙星土壤的效果明显优于游离微生物处理；固定化微生物组中降解效果随温度升高而升高，可能原因是达到酶活的合适温度，但温度过高可能对微生物生长不利。该菌对于气候温暖湿热的南方地区十分适用。

2.3重金属离子对蔗渣固定化aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤的影响。

土壤中的重金属离子污染日益严重，实验选取重金属离子cd²⁺和pb²⁺探究重金属离子存在时蔗渣固定化aspergillus-438处理环丙沙星污染土壤的效果。在100mg/kg环丙沙星污染土的基础上，根据土壤重金属离子污染现状，分别制备重金属离子cd²⁺的污染浓度为10mg/kg、重金属离子pb²⁺的污染浓度为100mg/kg的模拟土壤。实验设置3组对照，使用固定化aspergillus-438处理不含重金属离子的对照组土壤、重金属离子cd²⁺的污染土壤及重金属离子pb²⁺的污染土壤。菌悬液与无机盐培养液的总含量为10ml，处理环丙沙星污染土壤10g，置于28℃培养，分别于第0、5、10、15d取样抽提，用高效液相色谱法测定环丙沙星的残留量并计算其降解率。

由图5可见，在其他条件相同的情况下，培养15d后，蔗渣固定化aspergillus-438对含重金属离子cd²⁺的污染土壤中的环丙沙星降解率为48.69％、对含重金属离子pb²⁺的污染土壤中的环丙沙星降解率为40.75％、对不含重金属离子的对照组土壤降解率为62.23％。可见重金属离子污染对于微生物的生长有一定的抑制作用，重金属离子pb²⁺的抑制作用更强，但蔗渣固定化aspergillus-438仍能使土壤中环丙沙星降解，说明蔗渣固定化aspergillus-438蔗不仅有较强的降解土壤中环丙沙星的能力，而且也有一定的环境适应能力。

应用例3：蔗渣固定化棘孢曲霉aspergillus-438处理诺氟沙星污染土壤

3.1诺氟沙星污染土壤按应用2中方法制备，不同接菌量对蔗渣固定化aspergillus-438处理诺氟沙星污染土壤的影响，即：按不同梯度添加菌悬液后用无机盐培养液补充至10ml，使混合液与干燥蔗渣的用量比为10ml︰1g

3.2在固定化微生物实验组中，固定化所用菌悬液的量为1％、5％、10％、15％、20％、25％，即所加菌悬液的量为0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，菌悬液与无机盐培养液的总含量为10ml，处理诺氟沙星污染土壤10g，置于28℃培养，其余做法与应用例2相同。分别于第0、5、10、15、20、25、30d取样抽提，用高效液相色谱法测定环丙沙星的残留量并计算其降解率。

由图6可见，在其他条件相同的情况下，培养30d后，接菌量为1％、5％、10％、15％、20％对环丙沙星土壤的降解率分别为38.66％、48.85％、41.6％、36.7％、37.5％。随着接种量的提高，由于生长空间与营养物质有限的情况下菌体成长会更快达到饱和，而接菌量太少，理论上虽然最终生长量会比接菌量多的大，但需要更多的培养时间，有害物质也会更多，反而抑制生长。综合以上两点，选取5％为最优固定化微生物的接菌量即能到较好的降解效果。

本发明以农业废料(蔗渣)作为载体经无机盐培养液处理后接种喹诺酮类抗生素高效降解菌，对降解菌进行培养，构建农业废料固定化微生物体系；将大量繁殖的固定化微生物加至受环丙沙星污染的水体或土壤中，混合均匀，在合适的温度和ph下培养，固定化生物能利用环丙沙星，使环丙沙星降解，从而达到快速修复抗生素污染水体或土壤的目的。