本发明属于生物技术领域，涉及一种红景天苷单克隆抗体制备方法与应用。
背景技术
红景天（rhodiola）是景天科(crassulaceae)红景天属(rhodida)植物,主要有效成分是红景天苷(salidroside)。红景天苷具有抗心肌缺血、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤等多种药理作用。红景天被用于多种中成药、保健品及化妆品中。测定红景天苷的方法已有一些报道，气相色谱法和薄层色谱法较少，最为常用的方法为高效液相色谱法。但这些传统检测方法依赖昂贵的精密仪器、检测成本高、前处理复杂、耗时长难以适应产品的快速检测的要求。尤其是在快速、大量检测中药有效成分,研究中药材、中药复方和中成药的有效成分含量、体内代谢过程等方面。
以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附法(elisa)检测方法具有快速、高灵敏、重复性好、前处理简单等特点，能够克服传统方法的缺点，有其独特的技术优势，可以在红景天药材的质量控制和评价，以及以红景天为主要成分的中成药、保健品中的检测分析、真伪鉴别、生产工艺过程质控等方面发挥重要作用。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种红景天苷单克隆抗体的制备方法与应用。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明所述的红景天苷单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
（1）完全抗原的制备：将红景天半抗原分别与牛血清蛋白（bsa）、卵清蛋白（ova）偶联得到免疫抗原和包被抗原；
准确称取两份红景天苷10mg于三角瓶内，分别加入20%甲醇10ml，超声溶解；称取两份高碘酸钠5mg，加水1ml溶解，将两份高碘酸钠溶液分别加入到红景天苷溶液中，加入磁力搅拌转子，避光、室温搅拌1h，制的两份相同的红景天苷溶液；准确称取bsa、ova各20mg，分别溶于2ml0.05mol/lcbs溶液，调节ph至9.6，完全溶解后，分别逐滴加入到两份红景天苷溶液中，匀速避光搅拌12h；剪下的透析袋ph9.60.05mol/lcbs溶液预处理，将搅拌后的两种混合液转移透析袋中，透析72h，中间每间隔6h换1次透析液，获得红景天苷-bsa和红景天苷-ova两种抗原；将经过透析处理后的两种抗原小量分装于1.5ml离心管中，-20℃冻存备用，避免反复冻融；
（2）动物免疫：取健康的6～8周雌性balb/c小鼠，以红景天苷-bsa作为免疫原，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为100μg；之后每两周颈背部皮下多点注射一次加强免疫，采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；第四次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量为100μg；通过间接elisa检测血清效价；
（3）细胞融合与阳性克隆筛选：融合前三天，腹腔加强免疫，不加佐剂直接注射抗原100μg；致死后无菌取免疫小鼠脾脏，并研磨脾脏，分散脾细胞，将细胞疏松后加10ml0.17mmnh4cl，冰浴低渗处理，脾细胞与骨髓瘤细胞按数量之比1:5比例混合，疏松后加入37℃预热的1mlpeg4000进行细胞融合；融合后细胞转入含巨噬细胞的96孔细胞培养板中，加入hat培养基进行选择培养，用间接elisa检测抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用有限稀释法，接种于96孔培养板内，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%；
（4）单克隆抗体的大量制备与特异性检测：取12周龄小鼠腹腔注射液体石蜡(每只0.4ml)。1周后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞，饲料中同质量的葵花籽进行喂食补硒，增加腹水产量，待小鼠腹部明显隆起时(注射后约10d)收集腹水，2000r/min离心10min，吸取上清分装，-20℃冻存。采用辛酸饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水，腹水效价测定用间接elisa方法。用间接竞争elisa法检测抗体特异性，包被抗原为红景天苷-ova根据od450判定所产生的抗体的特异性。
(5)抗体的应用：利用本发明制备的红景天苷单克隆抗体，效价为256000，建立了间接竞争elisa测定方法，灵敏度为1.84ng/ml；与红景天苷类似物的交叉反应率均小于1%，基本无交叉反应。
有益效果：
与传统的高效液相色谱法（hplc）结果比较，在应用hplc法检测样品中某种物质的含量时，通常需要进行复杂的前处理，不利于大量样品数的同时测定；且操作时间冗长，所用流动相又多为有机溶剂，污染环境且对身体健康不利。elisa法检测样品中某物质的含量时，预处理简单，可以同时检测批量样品，灵敏度高，操作简便。
附图说明
图1以抑制率达到50%时所对应的红景天苷质量浓度为半数抑制率为间接竞争elisa的灵敏度结果图。单克隆抗体抗红景天苷灵敏度为49.33ng/ml。检出限ic10为1.77ng/ml，该法的检测线性范围(ic20-ic80)为4.07-598.45ng/ml。
具体实施方式
实施例1完全抗原的合成
准确称取红景天苷10mg于三角瓶内，加入20%甲醇10ml，超声溶解。称取高碘酸钠5mg，加水1ml溶解，将高碘酸钠溶液加入红景天苷溶液中，加入磁力搅拌转子，避光、室温搅拌1h。准确称取bsa、ova各20mg，分别溶于2ml0.05mol/lcbs溶液，调节ph至9.6，完全溶解后，逐滴加入到上述红景天苷溶液中，匀速避光搅拌12h。剪下的透析袋cbs（ph9.6）预处理，将搅拌后的混合液转移透析袋中，透析72h，中间每间隔6h换1次透析液。将经过透析处理后的两种抗原小量分装于1.5ml离心管中，-20℃冻存备用，避免反复冻融。
实施例2动物免疫
选取5只小鼠为实验组，初次免疫以红景天苷-bsa与弗式完全佐剂充分乳化后的混合物为免疫原，100μg/只，皮下多点注射实验组；每两周加强免疫一次，改用弗式不完全佐剂乳化红景天苷-bsa抗原，免疫剂量不变。第4次免疫后一周断尾取血与1ml离心管中，开盖自然放置至有血清析出，以红景天苷-ova为包被原，间接elisa测定抗血清效价。
实施例3细胞融合
融合前72h，腹腔加强免疫(不加佐剂，直接注射红景天苷-bsa抗原100μg)。小鼠致死后，无菌取免疫小鼠脾脏，并研磨脾脏，分散脾细胞，将细胞疏松后加10ml0.17mmnh4cl，冰浴低渗处理10min，1000r·min-1离心5min，收集骨髓瘤细胞离心弃去上清，加入不完全培养基重悬细胞台酚蓝染色后计数，将脾细胞与骨髓瘤细胞按1:5比例混合，1000r·min-1离心5min，疏松后1min内缓缓加入1ml37℃预热的peg进行细胞融合，捻转3～5min，缓慢加入dmem培养基20ml，同上离心，弃上清液，重悬杂交瘤细胞于含15%牛血清的hat培养基中，调节至每毫升约106个细胞，加到96孔细胞培养板，0.1ml/孔，置37℃，5％co2培养箱中培养。
实施例4阳性杂交瘤细胞的筛选、克隆
1）阳性杂交瘤细胞的筛选
细胞融合第5d补加0.1ml含15%牛血清的hat培养基，每天观察杂交瘤生长情况一次，待细胞长至孔底的1/5～1/3时，取上清进行间接elisa和间接竞争elisa检测，筛选杂交瘤细胞生长阳性孔。
间接elisa和间接竞争elisa如下：
间接elisa：加入用包被缓冲液包被抗原1:2000稀释的红景天苷-ova，100μl/孔包被过夜；洗板后加封闭液，150μl/孔，37℃孵育2h；洗板后加入细胞培养上清30μl/孔，补加pbst70μl/孔，37℃孵育1h，洗板5次；加入酶标羊抗鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板5次；加入显色液，每孔100μl，37℃，10～15min；每孔加入50μl2mh2so4终止液，酶联免疫检测仪测定450nm处吸光度值；测定细胞上清液是否为阳性(od450>0.5，阴性对照od450<0.2)，选择阳性克隆进入下一轮筛选。
间接竞争elisa：加入用包被缓冲液包被抗原1:2000稀释的红景天苷-ova100μl/孔包被elisa板过夜；洗板后加入封闭液，150μl/孔，37℃孵育2h；洗板后加入红景天苷标准品100ng/ml与细胞培养上清各50μl，37℃孵育1h；洗板5次；加入酶标羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h，洗板5次；每孔100μl显色液，37℃孵育10～15min；每孔加入2mh2so4终止液50μl，酶联免疫检测仪测定450nm处吸光度值，并与不加入竞争抗原的孔进行比较。具有竞争特性的抗体，使加入红景天苷抗原的孔od450降低。选择上清液效价高、竞争抑制效果好、生长旺盛的细胞株进行下一步克隆。
2）饲养层细胞的制备
8周龄左右的balb/c小鼠，无菌操作，腹腔注射10mldmem培养液，轻揉小鼠腹腔数次，用灭菌12号针头在超净台内引出注入的培养液。计数后调整细胞浓度至2×105/ml，加入96孔细胞培养板，100µl/孔，置37℃，5％co2培养箱中培养备用。
3）阳性杂交瘤细胞的克隆
采用有限稀释法，取经elisa结果为阳性、od值高、细胞生长旺盛、形态较好，且不与正常细胞抗原反应的杂交瘤细胞，从96孔移至24孔细胞培养板，取对数生长期的细胞经计数后，用含15%牛血清的dmem逐步稀释至20个细胞/ml，加到含饲养层细胞的96孔培养板中，每孔滴加一滴（约含1个细胞），置37℃，5％co2培养箱中培养。5d后观察克隆细胞生长情况，挑选只含一个细胞克隆的孔，做好标记并补加培养液，继续培养。待细胞克隆生长至1/3孔底或上清液变黄时，取上清用间接elisa检测。连续克隆3次，直至克隆孔阳性率达100%，克隆过程各阶段细胞同时扩大培养并冻存。
4）细胞的冻存
选择对数生长期的细胞，轻轻从细胞壁吹下，1000r/min离心10min，弃上清。用冻存液将细胞悬浮，分装于冻存管，加盖密封后注明代号，于-70℃过夜，次日移入液氮罐内长期保存。
实施例5单克隆抗体的大量制备
选取12周龄balb/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前1～2周，腹腔注射灭菌的液体石蜡进行诱导，0.4ml/只，分笼饲养，饲料中添加葵花籽补硒，增加腹水产量。
取对数生长期的杂交瘤细胞，经1000r/min离心5min沉淀细胞，用不含血清的dmem约0.5～1ml重悬，腹腔注射已用液体石蜡诱导的balb/c小鼠，每只小鼠注射约1×106杂交瘤细胞。约7～10d后观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大时，用12号针头无菌由腹腔下侧穿刺，引流收集腹水，2000r/min离心10min，收集上层淡黄色腹水，纯化，冻于-70℃备用。
试验例1抗体效价测定
抗红景天苷单克隆抗体效价的测定
按照常规的间接elisa法进行检测，包被抗原1:2000稀释，100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜；弃包被液，pbst洗液200μl/孔，洗涤3次，每次2min；加入5％脱脂奶封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h；洗涤3次，每次2min；红景天苷单克隆抗体用ph7.4的pbs溶液作2倍比稀释，100μl/孔，最后一列加阴性血清对照组，37℃反应30min；洗涤3次，加入l:10000倍稀释的hrp-羊抗鼠二抗igg，100μl/孔，37℃反应30min；洗涤3次，每次2min；，加入tmb显色液，100μl/孔，室温避光放置15min，加入2mol/lh2so4终止反应，50μl/孔。用酶标仪测定od450值。并按下列公式计算p/n值：p/n值＝阳性对照孔od450均值/阴性对照孔od450均值。当p/n值>2时，阳性血清最高稀释倍数作为血清的elisa效价。
经测定，本发明制备的红景天苷单克隆抗体的效价达到256000，与抗原的结合能力强。
试验例2基于红景天苷单克隆抗体建立的间接竞争elisa分析方法
通过间接竞争elisa中加入不同浓度的竞争抗原红景天苷测得。以,1:2000稀释的红景天苷-ova作包被原，将最适浓度1:20000稀释的单克隆抗体50μl与不同浓度的红景天苷标准溶液50μl(1.0-1000ng/ml)分别混合后加入酶标板中，每个浓度做3次重复，加入羊抗鼠二抗，tmb显色，终止显色后放入酶标仪测od450。以不同红景天苷浓度的od450值与浓度为0ng/ml时的od450的比值b/b0为横坐标，标准曲线方程为y＝-0.1202lnx+0.9686(r2＝0.996)。检测限ic10为1.77ng/ml，检测范围(ic20-ic80)为4.07-598.45ng/ml，半数抑制率ic50为49.33ng/ml。相对标准偏差(relativestandarddeviation,rsd)均小于10％。
试验例3间接竞争elisa分析方法的精密度测定
取4个不同质量浓度的红景天苷样品(1,10,100,1000ng/ml)按照上述所建立的间接竞争elisa法进行测定,每次设置3个平行孔,连续3天内每个实验重复3次，分别进行日内精密度和日间精密度的测定。对3次平行测定结果进行数据分析可知,平行孔之间检测值相对标准差(rsd)为0.94%-4.41%，各酶标板之间检测值相对标准差(rsd)为1.11%-4.03%。
表1红景天苷标准溶液的检测精密度
试验例4间接竞争elisa分析方法的回收率测定
精密称取已知红景天苷含量（0.58mg/g）的红景天胶囊粉末共4份，分别加入不同体积红景天苷标准品溶液使其加入量为0.1mg/g、1mg/g、10mg/g，按上述间接竞争elisa法对其进行测定。回收率测定结果如表2所示,其回收率为91.2%-96.7%,均值为93.9%。
表2间接竞争elisa法回收率检测结果
试验例5建立的间接竞争elisa方法与hplc法测定红景天苷含量的比较
选择市面上常见的4种以红景天为主要成分的红景天胶囊，利用本发明中建立的间接竞争elisa测定其中红景天苷的含量，同时，用hplc法测定这4种样品的红景天苷含量，结果如表1所示。从表1中可以看到，已建立的elisa法与hplc法检测4种市售中成药、保健品中红景天苷的含量基本一致，这证明用elisa法快速检测红景天苷的含量是可行的。液相色谱法是最常用的测定红景天苷含量的方法，本发明建立的间接竞争elisa法与其相比，灵敏度更高，操作更简便，用时更短，并且能够批量测定样品，能够为红景天质量评估提供更好的手段。
表3间接竞争elisa法和hplc法测定若干红景天苷的结果比较
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。