基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物与流程

本发明涉及农作物抗病分子育种技术领域，具体涉及基于双重pcr对大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物。

背景技术

黄矮病是由蚜虫传播的大麦黄矮病毒(barleyyellowdwarfvirus，简称bydv)侵染所引起的一种全球性的主要麦类病毒病害。染病后主要表现为叶片黄化、植株矮化、产量减少、品质下降等症状。因而，该病有“黄色瘟疫”之称。全球麦类产区因该病造成的年均损失为11～33％，有些地区甚至高达86％。

选育抗病品种是防治该病最经济、安全、有效的途径。然而，麦类中抗病基因贫乏，仅在埃塞俄比亚大麦种质中发现的yd2基因对黄矮病具有高而持久的抗性。yd2基因是世界上迄今发现的最优异的抗黄矮病基因。目前，国外已经成功地将yd2基因导入了主栽大麦中，培育出了一些抗病品种。尽管如此，yd2基因在育种实践中仍没有得到充分利用。

yd2基因抗性育种所面临的一个最大挑战是育种分离世代中携带yd2基因个体的筛选十分困难。常规的生物学抗性检测非常繁琐，而且也很难准确地鉴定其抗性水平以及判断yd2基因的有无，这就极大地限制了yd2基因在大麦抗病育种中的广泛应用。yd2基因属于不完全显性，纯合时高抗，杂合时其抗性则随遗传背景的差异而不同，可能高抗，也可能感病。然而，在育种分离世代中往往是对杂合个体的筛选，这使得yd2基因的育种筛选更加困难。

如果采用dna分子标记辅助选择的方法可直接在各育种分离世代的大麦幼苗期对yd2基因进行鉴定与筛选，能够克服上述局限，可极大地提高抗性育种的效率，有利于yd2基因在抗病育种实践中的广泛应用。

若要对大麦yd2基因进行分子标记辅助育种选择，筛选到与yd2基因紧密连锁的标记则是其重要前提。paltridege等(1998)在大麦第3条染色体上找到了1个与yd2基因紧密连锁(0.7cm)的共显性标记ylm，该标记能用于检测yd2基因的有无，也能鉴别yd2基因型，且操作简单，成本低，但准确度却不够高，存在一定的选择偏差与风险。ford等(1999)也在大麦中找到了1个与yd2基因几乎处于共分离的标记caps-ylp(＜0.3cm)，该标记为共显性标记，检测yd2基因的准确度很高，且能识别yd2基因型，但因其属于caps标记，需要pcr扩增后，再进行1次酶切才能完成检测，操作繁琐，成本高，不适合大规模分子标记辅助育种选择。鉴于此，ford等(1999)又基于该ylp标记位点将其改造成1个仅需一步pcr就可完成的显性标记aspcr-ylp，操作简化了，而且能准确地鉴定yd2基因的有无，但却不能鉴别yd2基因型了。另外，作为显性标记，aspcr-ylp是通过1条268bp电泳条带的有无来判断大麦是否携带yd2基因。然而，那些pcr扩增失败的大麦材料往往会被误判为是不携带yd2基因的材料。由此可见，以上涉及的来自2个标记位点(ylm位点和ylp位点)的3种标记(ylm、caps-ylp和aspcr-ylp)各自存在着优缺点。迄今为止，它们仍然是大麦中已发现的离yd2基因最近的标记。曾有人在大麦抗黄矮病育种中利用这些标记来进行yd2基因的单标记辅助选择，已取得了一定的成效，但均因其各自缺点，最终都没有被作为理想的分子标记在大规模的分子标记辅助育种中加以广泛利用。赵彦宏等(2001)发现这3种标记检测方法存在互补性，将这3种单标记检测配合起来同时考察这2个标记位点，可取长补短，相互验证，提高准确性。然而，采用单标记检测来考察2个标记位点基因型，至少需要2次pcr扩增检测才能完成，这显然不利于大规模的分子标记辅助育种选择。

一般认为，最理想的分子标记辅助育种选择方法应该同时符合如下几个特点：(1)鉴定与筛选目标基因的准确性高(这要求所用标记与目标基因遗传距离非常近)；(2)所用标记最好为共显性标记，既能鉴定目标基因的有无，同时还能判定其基因型；(3)操作简单、快速有效，而且成本较低；(4)适合大规模的育种选择。

显然，现有的大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法并不完全符合理想分子标记辅助选择的特点。正因如此，迄今为止，尚未有十分理想的适合大规模抗病育种选择yd2基因的分子标记辅助选择方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种与大麦yd2基因紧密连锁的分子标记引物——两对特异引物对mym和myp，利用双重pcr技术能够同时检测双标记位点，不仅能准确检测yd2基因的有无，而且也能直接判定其基因型。

本发明的另一目的是提供一种利用双重pcr技术对大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法，该方法能够在大麦抗黄矮病育种中准确、快速、简单、有效地筛选出抗病材料。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明根据与大麦yd2基因紧密连锁的2个分子标记(ylm与aspcr-ylp)信息，首先重新设计了引物，并对这2个标记进行了改造(经改造后的标记改称为mym标记和myp标记)，然后建立了一种通过一次pcr反应就可同时检测双标记位点的双重pcr检测方法。利用该检测方法，可简单、快速、准确地鉴定任何世代大麦个体中yd2基因的有无，同时也能鉴定其yd2基因型。基于该双重pcr检测方法，进而发展出了一种大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法。具体如下：

其中，引物对mym的正向引物序列如seqidno.1所示，其反向引物序列如seqidno.2所示，引物对myp的正向引物序列如seqidno.3所示，其反向引物序列如seqidno.4所示。

其中，利用双重pcr技术对大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法，具体步骤如下：

(1)提取待检测大麦各育种世代材料的基因组dna；

将大麦抗黄矮病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长到4～6片叶之后，每株取1片幼叶，可以采用采用改良的ctab法或简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna，并且方法不限于此，凡是能将基因组dna提取的方法均可。

其中简易快速naoh提取方法(见wangh，etal.1993.asimplemethodofpreparingplantsamplesforpcr.nuclacidsres，21：4153-4154)更适合大规模育种筛选，其主要步骤为：取少量新鲜大麦叶片放入研钵中，每毫克叶片加入10μlnaoh(0.5mmol/l)，然后研磨制成匀浆；用10倍体积的tris-hcl(0.1mmol/l，ph8.0)稀释，离心后吸取上清，获得dna粗提液，保存备用。

(2)以待测大麦材料的基因组dna为模板(也可以用上面的简易快速naoh提取方法获得dna粗提液作为模板)，利用与大麦yd2基因紧密连锁的2个分子标记序列，设计出的2对特异引物(seqidno.1～seqidno.4)，进行双重pcr扩增与电泳检测；

①双重pcr扩增所用的2对特异引物序列为：

mym-f：5′-ggagaacaggagctggtgaa-3′(seqidno.1)

mym-r：5′-aaatttaaagggctccgtga-3′(seqidno.2)

myp-f：5′-atatacaggggcttgcttcg-3′(seqidno.3)

myp-r：5′-tggtcaactagtatctctggctcag-3′(seqidno.4)

②双重pcr扩增的反应体系为：

扩增反应总体积为10μl，含20～50ng大麦模板dna(或者3dna粗提液)，1×pcrbuffer，0.24mmoll^-1dntp，1.5mmoll^-1mgcl2，1.5utaqdna聚合酶，myp标记上下游引物各0.2μmoll^-1，mym标记上下游引物各0.6μmoll^-1；两引物对浓度比例为：myp引物对/mym引物对＝1/3。

③双重pcr扩增的反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后总延伸5min，4℃保温。

④双重pcr产物的电泳检测：

采用2.0％～2.3％琼脂糖凝胶进行电泳检测。取双重pcr产物直接点样于凝胶点样孔，样品与不含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液混合后点样；dnamarker与含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液混合点样，作为电泳指示与参照。电泳结束后，凝胶经eb浸泡30～60分钟，最后用紫外凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。

(3)根据双重pcr产物电泳检测结果中152bp、100bp、111bp三种条带的出现情况，判定大麦材料的是否携带yd2基因，并直接确定其yd2基因型；具体方法特征如下：

①若为152bp+100bp带型，可判定携带yd2基因，而且其基因型为yd2⁺/yd2⁺；

②若为152bp+100bp+111bp带型，则判定携带yd2基因，且基因型为yd2⁺/yd2^-；

③若只出现111bp条带，则判定不含yd2基因，其基因型为yd2^-/yd2^-。

(4)大麦育种分离世代的分子标记辅助选择步骤：

按照步骤(1)～(3)的方法检测育种分离世代个体后，根据判定的yd2基因型的结果对其各世代分离群体加以选择，具体方法如下：

①杂交育种程序中yd2基因的分子辅助选择方法：

仅需在f2代中进行检测，选出152bp+100bp带型个体，即为抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)。之后世代(f3～fn)无需再对yd2选择。只需按照常规的育种选择方法对综合性状表现来进行株系选择。最后，从趋于稳定的fn代中选出的优良单株就是既抗黄矮病且综合性状优良的单株。

②回交育种程序中yd2基因的分子辅助选择方法：：

bc1f1～bcnf1世代：每代检测并选出152bp+100bp+111bp带型个体(基因型为yd2⁺/yd2^-)作为非轮回亲本参与下轮回交；

bcnf2世代：选出152bp+100bp带型大麦单株，即为抗性纯合个体(基因型为yd2⁺/yd2⁺)；可直接省去bcnf3世代。

另外，本发明设计的基于双重pcr技术对大麦yd2基因分子标记辅助选择过程中选用的专用引物在鉴定植物yd2基因的有无及其基因型方面的应用，以及所述专用引物在回交育种或杂交育种中选育大麦抗黄矮病植株中的应用等均落入本发明的保护范围。

本发明和现有技术相比具有以下改进及有益效果：

(1)本发明在背景技术中所提到的2个标记(ylm标记与aspcr-ylp标记)各自单独pcr检测时，都能获得预期结果，但发明人在试验时发现，将其原有2对引物直接混在一起进行双重pcr扩增时，却总会失败，通常只能扩增出aspcr-ylp标记的目标产物，却不能扩增出ylm标记的目标产物。即使经过多次调整pcr反应体系与反应条件，也均未获得成功。本发明首先进行了引物重新设计与标记改造，重新设计的引物其用双重pcr扩增效果好，条带非常亮，条带特异，效果非常好，能够很好地判断yd2基因的有无及其基因型。

(2)在试验过程中发明人还对分子标记双重pcr检测方法进行了重新优化，通过试验得出当myp引物对浓度/mym引物对浓度＝1/3，且myp标记上下游引物各0.2μmoll^-1，mym标记上下游引物各0.6μmoll^-1时，双重pcr检测效果较佳，并且还对退火温度进行了优化、双重pcr产物的电泳检测进行调整优化与改造，得出最佳的利用双重pcr技术对大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法。

(3)检测筛选的准确性高。

本发明通过一次双重pcr同时检测双标记位点来鉴定yd2基因。所用的这两个标记位点均与yd2基因高度连锁，而且其中一个标记(myp)与yd2基因几乎为共分离。双标记位点同时检测可相互印证，相互检验，确保检测的高准确度和高可靠性。

(4)不仅能准确检测yd2基因的有无，而且也能直接判定其基因型。

在用于检测的两个标记中，其中一个标记(myp)在检测yd2基因时准确度高，但却是显性标记，不能判断大麦的yd2基因型，而另一个标记(mym)是共显性标记，可以直接鉴别yd2的基因型，但其准确性稍低。同时检测两个标记可取长补短，优势互补，既能准确鉴定yd2基因的有无，同时也能直接判定其基因型。这对育种分离世代的大麦个体选择非常有利。

(5)操作简单、快速，且成本较低，非常适合大规模的育种选择。

本方法在单个pcr管中一次pcr反应就可完成双标记的检测，操作简单快速，在准确度与可靠性提高的同时却没有增加成本。另外，本发明建立的双重pcr检测对大麦模板dna要求不太高，即使利用简易快速naoh提取方法提取的dna粗体液也能满足。这就使得dna提取变得非常简单与快速，大幅降低了dna提取的成本和缩短了时间，非常适合大规模育种选择。

(6)大幅降低育种选择的工作量，缩短育种周期，加快育种进程。

本方法能鉴别育种分离世代大麦材料的yd2基因型，可直接选出抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)。杂交育种中，仅需一代(f2)检测筛选，就可直接获得抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)，省去了多代检测筛选。回交育种中，在bcnf2世代就可直接筛选出抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)，根本无需再种植bcnf3世代。可见，利用该方法能够大幅降低育种选择的工作量，提高选择效率，减小育种规模，缩短育种周期，加快育种进程。

总的说来，本发明提供的基于双重pcr的大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法，已基本符合理想分子标记辅助选择的特点。该方法的应用将有助于促进yd2基因在抗病育种实践中的广泛应用。

附图说明

图1为新设计引物对的pcr验证结果。

图中1-6依次为mym1、mym2、myp1、myp2、myp3和myp4引物对，m为100bpladderdnamark。

图2为利用本发明所述的基于双重pcr的yd2基因检测方法对14个已知yd2基因型的大麦材料的检测与验证结果。

图中1、4、5、6、8、10、12、14是基因型为yd2⁺/yd2⁺的大麦材料，2、3、7、9是基因型为yd2^-/yd2^-的大麦材料，11和13是基因型为yd2⁺/yd2^-的大麦材料，m为100bpladderdnamark。

图3为利用本发明所述的基于双重pcr的yd2基因检测方法对16个已知yd2基因型的大麦材料的检测与验证结果。

图中泳道2、3、4、5、6、7、10、12、13和15是基因型为yd2⁺/yd2⁺的大麦材料，1、8、9、11和14是基因型为yd2-/yd2-的大麦材料，16是基因型为yd2⁺/yd2^-的大麦材料，m为100bpladderdnamark。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

试验例

1、提取待检测大麦各育种世代材料的基因组dna

考虑到更加适合大规模分子辅助选择，本发明涉及的双重pcr检测除了用常规的dna提取方法获得的大麦基因组dna作为模板外，还尝试了使用简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna作为模板，结果显示，使用简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna(即dna粗体液)作为模板进行双重pcr检测，同样能获得预期效果。具体方法如下：

将大麦抗黄矮病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长到4～6片叶之后，每株取1片幼叶，采用改良的ctab法或简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna。

采用简易快速naoh提取方法(具体提取方法参见wangh，etal.1993.asimplemethodofpreparingplantsamplesforpcr.nuclacidsres，21：4153-4154)更适合大规模育种筛选，并且该方法的主要步骤为：取少量新鲜大麦叶片放入研钵中，每毫克叶片加入10μlnaoh(0.5mmol/l)，然后研磨制成匀浆；用10倍体积的tris-hcl(0.1mmol/l，ph8.0)稀释，离心后吸取上清，获得dna粗提液，保存备用。

2、双重pcr检测的引物设计及引物对组合的验证筛选

双重pcr并不是简单地将原有pcr的两对引物直接混合在一起pcr扩增就能成功的，必须重新设计引物与重建pcr反应技术体系。

(1)双重pcr检测所用引物的设计

本发明所涉及的2个标记(ylm标记与aspcr-ylp标记)各自单独pcr检测时，都能获得预期结果，但如果将其原有2对引物直接混在一起进行双重pcr扩增时，却总会失败，通常只能扩增出aspcr-ylp标记的目标产物，却不能扩增出ylm标记的目标产物。即使经过多次调整pcr反应体系与反应条件，也均未获得成功。失败的可能原因是：2对原有引物在gc含量、退火温度、与模板dna结合力等方面差异太大，在互相竞争资源时，竞争力强弱差距过大；2对原有引物对混合时也可能会形成二聚体。所以，本发明首先进行了引物重新设计与标记改造，将经改造后的标记分别改称为mym标记与myp标记。

引物设计的具体步骤如下：

①引物设计所用模板序列准备：

以genbank数据库中提取出与ylm标记对应的大麦序列ylm-s(af030407.1)作为查询序列，利用blast工具从大麦的基因组序列中进行相似性搜索，获得了1条与此相匹配的长度为2389bp的大麦基因组dna序列，然后将此作为mym标记引物设计的模板序列。

同样地，从genbank数据库中提取出与ylp标记对应的ylp-s的cdna序列(hvu84268)，将其作为查询序列，从大麦基因组序列中进行blast相似性搜索，获得了1条与其对应的长度为12,412bp的大麦基因组dna序列(contig_43585)。然后将此作为myp标记设计的dna模板序列。

②引物设计：

基于上面的模板序列，采用引物设计软件primer3.0来设计出双重pcr检测所用的引物。最终设计出与原来标记所用引物完全不同的4对myp引物与2对mym引物，以作为多重pcr检测的候选引物，见表1：

表1.新设计的双重pcr候选引物对

(2)设计合成的单对新引物的pcr扩增验证

在设计合成用于双重pcr的新引物之后，首先分别对单对新引物的扩增效果进行了检测与验证。以1对yd2基因的近等基因系大麦材料atlas与atlas68的基因组dna作为模板，将合成的4对对myp引物(myp1、myp2、myp3和myp4)以及2对mym引物(mym1和mym2)分别进行单标记引物的pcr扩增检测，用于验证新合成的单对引物的pcr扩增的效果。

扩增检测结果显示，用于探测myp标记位点的4对合成引物都能扩增出了预期大小的片段，而且条带非常亮，条带特异，效果非常好，能够很好地判断yd2基因的有无(见图1和表1)。用于探测mym标记位点的2对引物也都能扩增出预期的片段，但mym1引物对pcr扩增出条带稍微有点模糊，引物对mym2扩增效果非常好(见图1和表1)。

(3)用于双重pcr检测的引物对组合的筛选与验证

将pcr扩增效果非常好的4对myp引物(myp1、myp2、myp3和myp4)与1对mym引物(mym2)组合成4组双重pcr检测引物，加以验证与筛选。结果显示，引物对myp2与引物对mym2组合在一起进行双重pcr检测的效果非常好，电泳检测的条带清晰且特异，另外，pcr产物大小也比较合适。因此，经筛选后本发明选用引物对myp2与引物对mym2组合作为双重pcr检测的引物组合。因此，最终确定的双重pcr检测所用引物为：

mym-f：5′-ggagaacaggagctggtgaa-3′(seqidno.1)

mym-r：5′-aaatttaaagggctccgtga-3′(seqidno.2)

myp-f：5′-atatacaggggcttgcttcg-3′(seqidno.3)

myp-r：5′-tggtcaactagtatctctggctcag-3′(seqidno.4)

3、分子标记双重pcr检测方法的建立与优化

(1)双重pcr检测方法的建立与优化：

以一对近等基因系大麦atlas68(yd2⁺/yd2⁺)与atlas(yd2^-/yd2^-)及其杂交子代f1(atlas68×atlas)为实验材料，通过对双重pcr检测反应体系、反应条件及电泳检测等进行了优化。

在优化各影响因素的过程中，重点考虑了2对引物之间的浓度比例、退火温度以及大麦dna模板质量等因素的影响。

①引物对浓度及比例优化：

在设计引物时，考虑到2对引物与模板结合能力的差异及其竞争关系，尽量使二者接近，但由于受到标记位点的限制，难免二者仍然会存在一定的差异。因此，本发明对引物对浓度及二者的比例进行了探索与优化。结果显示：当myp引物对浓度/mym引物对浓度＝1/3，且myp标记上下游引物各0.2μmoll^-1，mym标记上下游引物各0.6μmoll^-1时，双重pcr检测效果较佳。

②退火温度优化：为了保证双引物对的目标产物都能扩增出来，同时能够避免非特异条带的干扰，进行了一系列的梯度退火温度实验，结果显示：当退火温度为60℃时，目标产物能很好地被特异性扩增。

③大麦dna模板质量要求：考虑到更加适合大规模分子辅助选择，本发明涉及的双重pcr检测除了用常规的dna提取方法获得的大麦基因组dna作为模板外，还尝试了使用简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna作为模板，结果显示，使用简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna(即dna粗体液)作为模板进行双重pcr检测，同样能获得预期效果。

④双重pcr产物的电泳检测的调整与改造：一是样品与不含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液混合后点样，而dnamark则是与含溴酚蓝的上样缓冲液混合点样，作为电泳指示与参照。这是因为溴酚蓝与预期扩增产物在凝胶中迁移速度相近，易影响电泳检测效果。二是制胶时不加eb，而是在电泳结束后，凝胶经eb浸泡30～60分钟加以染色，最后再用紫外成像仪观察。这是由于经过较长时间电泳才能将111bp和100bp条带明显分离开来，而较长的电泳时间会导致胶中预先加入的eb(带微弱正电荷)向点样孔方向移动，从而影响111bp和100bp条带的显色效果。如果等到电泳结束后再用eb浸泡，则可克服这个问题。

实施例1用已知yd2基因型的大麦材料验证本发明在鉴定yd2基因的有无及其基因型方面的应用

用22份已知yd2基因型的经典大麦材料(见表2)来验证本发明提供的基于双重pcr的大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法在鉴定yd2基因型方面的效果。实施步骤如下：

(1)大麦材料基因组dna提取：

将22份已知yd2基因型的经典大麦材料(其中包括3对杂交组合获得的大麦f1材料)的种子播种在花盆中，待幼苗长到4～6片叶以后，每株取1片嫩叶，采用简易快速naoh提取方法提取大麦基因组dna。具体步骤为：取少量新鲜大麦叶片放入研钵中，每毫克叶片加入10μlnaoh(0.5mmol/l)，然后研磨制成匀浆；用10倍体积的tris-hcl(0.1mmol/l，ph8.0)稀释，离心后吸取上清，获得dna粗提液，保存备用。

(2)双重pcr扩增检测：

以上面通过简易快速naoh提取方法简易快速提取大麦材料的基因组dna(dna粗体液)为模板，利用2对特异引物(seqidno.1～seqidno.4)，进行双重pcr扩增与电泳检测。

①双重pcr扩增所用的2对特异引物序列为：

mym-f：5′-ggagaacaggagctggtgaa-3′(seqidno.1)

mym-r：5′-aaatttaaagggctccgtga-3′(seqidno.2)

myp-f：5′-atatacaggggcttgcttcg-3′(seqidno.3)

myp-r：5′-tggtcaactagtatctctggctcag-3′(seqidno.4)

②双重pcr扩增的反应体系为：

扩增反应总体积为10μl，其中包括3μl大麦dna粗提液，1×pcrbuffer，0.24mmoll^-1dntp，1.5mmoll^-1mgcl2，1.5utaqdna聚合酶，myp标记上下游引物各0.2μmoll^-1，mym标记上下游引物各0.6μmoll^-1；两引物对浓度比例为：myp引物对/mym引物对＝1/3。

③双重pcr扩增的反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后总延伸5min，4℃保温。

④双重pcr产物的电泳检测：

采用2.3％琼脂糖凝胶进行电泳检测。取7μlpcr产物，在不加上样缓冲液的情况下，直接点样。取2μl100bpladderdnamarker与含指示剂的上样缓冲液混合点样，作为电泳参照物。电泳结束后，凝胶经eb浸泡30分钟，最后用紫外凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。

(3)根据双重pcr产物电泳检测结果，获得了这22个已知yd2基因型大麦的标记检测带型，由此推断出了各自的yd2基因型(见表2、图2与图3)。

表222份已知yd2基因型的经典大麦材料的双重pcr检测结果

注：表中r表示抗病，s表示感病，+/+表示其基因型为yd2⁺/yd2⁺，+/+表示其基因型为yd2^-/yd2^-，+/-表示其基因型为yd2⁺/yd2^-。

经比较发现，用本发明提供的检测方法所推断的22份大麦材料的yd2基因型与已知的基因型是一致的，这证明了本发明的双标记多重pcr检测方法在鉴定大麦材料yd2基因型方面具有非常高的准确性。

实施例2：在大麦yd2基因回交育种程序中的分子标记辅助选择应用

以大麦atlas68(yd2⁺/yd2⁺)为yd2基因供体，morex(yd2^-/yd2^-)为轮回亲本，通过回交育种程序，并利用本发明提供的基于双重pcr的大麦抗黄矮病基因yd2的分子标记辅助选择方法对其加以检测筛选，最终选育获得了遗传背景为morex且含有抗性基因yd2的纯合抗性新品系。

具体实施过程如下：

1.大麦atlas68(yd2⁺/yd2⁺)与morex(yd2^-/yd2^-)杂交获得f1；再用轮回亲本morex与f1回交，获得bc1f1。

2.回交分离世代(bc1f1～bc5f1)的分子标记辅助育种选择：

(1)bc1f1世代抗性基因的分子标记辅助选择：

种植bc1f1代群体，在苗期(3～5片叶子后)取1片叶子，采用本发明所述的简易快速naoh提取方法快速提取这些大麦植株的dna(dna粗提液)。然后利用本发明所述的双重pcr检测方法检测大麦植株的yd2基因型。具体步骤如下：

①双重pcr扩增所用的2对特异引物序列为：

mym-f：5′-ggagaacaggagctggtgaa-3′(seqidno.1)

mym-r：5′-aaatttaaagggctccgtga-3′(seqidno.2)

myp-f：5′-atatacaggggcttgcttcg-3′(seqidno.3)

myp-r：5′-tggtcaactagtatctctggctcag-3′(seqidno.4)

②双重pcr扩增的反应体系为：

扩增反应总体积为10μl，3μl大麦dna粗提液作为模板，1×pcrbuffer，0.24mmoll^-1dntp，1.5mmoll^-1mgcl2，1.5utaqdna聚合酶，myp标记上下游引物各0.2μmoll^-1，mym标记上下游引物各0.6μmoll^-1；两引物对浓度比例为：myp引物对/mym引物对＝1/3。

③双重pcr扩增的反应条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后总延伸5min，4℃保温。

④双重pcr产物的电泳检测：

采用2.3％琼脂糖凝胶进行电泳检测。取7μlpcr产物，在不加上样缓冲液的情况下，直接点样。取2μl100bpladderdnamarker与含指示剂的上样缓冲液混合点样，作为电泳参照物。电泳结束后，凝胶经eb浸泡30分钟，最后用紫外凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。

⑤大麦yd2基因型判定与bc1f1单株选择：

根据上面的电泳结果，选出了21株具有152bp+100bp+111bp带型的个体，这些个体的推定基因型为yd2⁺/yd2^-。在田间，对筛选出的这21个植株挂牌标识，并将其与轮回亲本morex继续回交获得bc2f1。

(2)bc2f1～bc5f1世代抗性基因的分子标记辅助选择：

与bc1f1世代一样，每个世代都是用同样的方法检测，筛选出具有152bp+100bp+111bp带型的个体，参与下一轮的回交。

3.自交分离世代(bc5f2)抗性个体的分子标记辅助选择：

将上面筛选出的bc5f1个体自交，获得bc5f2，自此进入自交分离世代。种植bc5f2群体，然后采用与上面相同的双重pcr检测方法进行鉴定筛选。最后，从中筛选出了23株具有152bp+100bp带型的大麦植株，即为抗性纯合个体(基因型为yd2⁺/yd2⁺)。

这样，就获得了具有稳定纯合的抗病新品系。整个回交育种程序自此结束，无需再自交获得bc5f3世代了。

另外，为了验证最终的选择效果，采用了常规的生物学抗性检测对最终选出的单株进行了抗性鉴定，结果显示，最后筛选出的23个bc5f2单株全部表现为高抗黄矮病。这证实了本发明的检测筛选方法是准确和可靠的。

实施例3：在大麦yd2基因杂交育种程序中的分子标记辅助选择应用

以高抗黄矮病的大麦材料atlas68(yd2⁺/yd2⁺)为父本，以感病大麦品种浙皮3号(yd2^-/yd2^-)为母本进行杂交育种，采用系谱法与分子标记辅助选择相结合的策略，从杂交分离世代中选出抗病的优良单株，最终培育出高抗黄矮病的优良新品系(yd2⁺/yd2⁺)。

具体实施过程如下：

1.以高抗黄矮病的大麦材料atlas68(yd2⁺/yd2⁺)为父本，以感病大麦品种浙皮3号(yd2^-/yd2^-)为母本，杂交获得f1；再自交得到f2。

2.f2世代：

(1)田间点播种植f2群体，在苗期(3-5叶子后)，剪下1片叶子，采用简易快速naoh提取dna的方法，快速提取大麦f2个体的基因组dna。

(2)采用本发明建立的多重pcr检测方法，检测f2群体中大麦个体的yd2基因型。这里所涉及的双重pcr检测方法的步骤与实例2相同。

(3)根据双重pcr检测结果，从中筛选出了103个具有152bp+100bp带型的个体，即为抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)。

(4)从103个抗性纯合个体(yd2⁺/yd2⁺)中又选出27个综合性状优良的单株。

3.f3及以后世代：

将选出的27个抗病且综合性状优良的f2单株(yd2⁺/yd2⁺)按株行种植。按照常规杂交育种中的系谱法对其选择与处理。

从f3世代开始，完全按照常规杂交育种中的系谱法对其综合性状进行选择与处理。不再进行抗性基因鉴定与筛选。

最后，从趋于稳定的f6代中选出的优良单株就是既抗黄矮病且综合性状优良的新品系。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。