一种人KI多瘤病毒的荧光定量PCR引物和探针及其应用的制作方法

本发明属于微生物检测技术，具体涉及一种人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针及其应用。

背景技术

ki多瘤病毒(karolinskainstitutetpolyomavirus,kipyv)是多瘤病毒科多瘤病毒属的新成员。近年来发现与人类呼吸道和胃肠道等感染有关，多瘤病毒(polyomaviridae)是无包膜病毒，直径40-50nm，其二十面体衣壳内含一个小的环状，双链dna基因组，基因组全长为5x103bp。多瘤病毒可感染哺乳动物和鸟类，易造成机体潜伏感染，具有致癌潜能。2007年，科学家又发现了两种新的人类多瘤病毒，在瑞典呼吸道感染患者的鼻咽抽提物(nasopharyngealaspirates,npa)和粪便中鉴定出kipyv，另外在急性呼吸道感染患者的临床呼吸道样本中发现了wu多瘤病毒(washingtonuniversitypolyomavirus,wupyv)。

多瘤病毒是在20世纪50年代开始引起多肿瘤的啮齿动物中意外发现的，现在已知多瘤病毒科的病毒可感染多种禽、啮齿动物和灵长动物。至今共发现32种多瘤病毒，其中包括10种人多瘤病毒(hpyv)，最早的人多瘤病毒bkv和jcv是40年代前在人类疾病中发现的，从2007年起，科学家陆续鉴别了8种新的人类多瘤病毒，它们分别是2007年在人类呼吸道和粪便中发现kipyv和wupyv；2008年在人类皮肤中发现的merkel细胞多瘤病毒(mcpyv)；在2010年在人皮肤上分析hpyv6、hpyv7及生毛细胞发育异常刺状多瘤病毒(tspyv)；2012年在人血清和皮肤中分析了hpyv9。在粪便和皮肤中分析了malawi多瘤病毒(malawipolyomavirus,mwpyv)。血清学研究表明hpyvs亚临床感染9％-82％的正常人。当机体免疫系统减弱时才会发生疾病。目前，人们对有关多瘤病毒的感染途径、传播和细胞向性知之甚少，对其在人类癌症中所扮演的角色也有争议。

多瘤病毒基因组编码2或3个早期蛋白和3个结构蛋白，早期基因编码ltag和stag，原癌转化是通过早期蛋白ltag和stag的作用产生的。nccr(non-codingcontrolregion,非编码调控区)是复制的起点，转录开始的位点(4968-440nt)。有许多看起来一致的序列作为启动子和增强子以便dna结合蛋白的结合和转录。所有hpyvs的nccr都含有富a/t区域及一些tag结合序列gaggc或gcctc。nccr调节病毒早期基因和晚期基因表达。在所有多瘤病毒中，ltag和stag的n端最初约82个氨基酸是相同的，ltag剪切位点基本是保守的，kipyv的ltag的n端含有t抗原共同的保守序列，包括j区域(相当于escherichiacoli的dnej位点)，即含高保守的六肽基序hpdkcg。ltag的保守区域定义了pyv的致癌潜能。ltag还包括许多功能性的重要序列信号：核定位信号、开始结合区域、螺旋的atpase区域及可能在细胞转化中扮演重要角色prb结合基序和p53相互作用区域。t抗原能结合atpase-p53和眼癌抑制蛋白rb并干扰它们的肿瘤抑制作用。t抗原结合rb的基序是lxcxe，在kipyv的ltag的108-112位。保守的atpase-p53结合基序是gpxxxgkt和gxxxvnle。在kipyv的ltag的434-411位。ltag的c端含有两个保守的锌指结合区域。多瘤病毒的stag和ltag的共同部位都有病毒复制和细胞转化的重要区域j-区域。在下游，stag含有一个pp2a亚单位结合基序可能激活与肿瘤细胞存活有关的akt-mtor途径。学者还发现stag的n端4个位点氨基酸处于强选择压力下。它们分别是位点1630(w、s、l、h、i)点1634(h、s、f、l、q、t)，位点1636(s、p、h、i、l、f)和位点1637(f、l、t、c)。病毒晚期基因编码3个结构蛋白-----壳粒蛋白vp1、vp2和vp3，它们共同组成了40-45nm的多瘤病毒衣壳。5个vp1分子形成一个壳粒与vp2或vp3分子自动组装成含有72个壳粒的五聚体。通过结合细胞表面的唾液酸残基，vp1在所有多瘤病毒进入细胞中扮演重要角色。

据报道kipyv在澳大利亚的感染季节在冬天(5-7月)，泰国的感染季节也在冬天(11-1月)。kipyv作为人类病原在全球都有分布，可能并没有明显季节性。有许多因子可能影响多瘤病毒流行和遗传进化，这些因子包括病毒传染性、人群的免疫原性和病毒抗原的可变性等。

在成年人呼吸道标本中kipyv感染的检出率为0.04％-2.7％。据报道kipyv在瑞典的检出率约为1％、在澳大利亚检出率约为2.5％、在英国检出率约为1.4％、在泰国检出率约为1.99％、在中国北京检出率约为0.5％、在甘肃兰州检出率约为2.7％、在浙江温岭检出率约为0.04％、在福建福州检出率约为0.4％，在中国各地检出率相差较多，原因有待进一步探讨。

科学家在粪便中也检测到kipyv，并且在粪便中检测到的与呼吸道检测到的kipyv在进化树分析中位于同一簇。两者意味kipyv可通过粪—口途径传播，人感染后表现出一定呼吸道和消化道的症状。血清学研究表明，人最初感染多瘤病毒一般发生在婴幼儿期。随后，人多瘤病毒以低水平的方式复制，持续、无症状地潜伏感染人体。为了解ki多瘤病毒的组织向性和潜伏位点，意大利学者检测了患者肺和鼻侧组织，在22例肺癌病例中有9例检测到kipyvvp1dna，还检测了91例患者的扁桃腺，其中11例含有kipyv的dna，检出率为12.1。种系分析表明从扁桃腺检测的kipyvs与从呼吸道和粪便中检出的kipyvs分别属于进化树上不同的簇。呼吸道应该是最初感染位点，多瘤病毒在扁桃腺中只是过客还是在疾病中扮演角色值得进一步关注；目前未在血液及尿液中发现kipyv。与kipyv感染有关的临床症状有上、下呼吸道的感染，包括咳嗽、支气管炎、细支气管炎和肺炎，还有发热、腹泻、痉挛、腹痛等，但kipyv作为独立病原的临床意义还有待于进一步研究。荧光定量pcr技术是近些年发展起来的分子生物学技术，以其快速、准确、可以定量等特点被广泛应用到各种检测体系中。

目前，缺乏一种能够快速、准确、高效地检测出样品的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针及其应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够快速、准确、高效地检测出样品的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针，所述上游引物具有seqidno.1的核苷酸序列；

所述下游引物具有seqidno.2的核苷酸序列；

所述探针具有seqidno.3的核苷酸序列。

具体的说，本发明内容是这样实现的：

根据genbank上人ki多瘤病毒全基因组序列(eu433556)，应用vectorntisuite9、primer5.0等程序设计检测vp1基因的引物和taqman探针。

进一步地，所述的引物和探针长度在20-30碱基之间。

进一步地，所述的引物和探针序列5’或3’末端化学标记(修饰)不同的基团。

更进一步地，所述的探针5’端标记fam或其他荧光基团，3’端标记tamra或其他荧光淬灭基团。

本发明的一种人ki多瘤病毒的试剂盒，包括所述的引物、探针和fret-pcr标准品。

本发明的一种人ki多瘤病毒的的荧光定量pcr扩增体系，所述的荧光定量pcr反应扩增体系：10×buffer，5.0ul；mg2+，3.5mm；dntp，200um；上下游引物均为0.2um；tanman探针，50nm；taq酶，1.25u；模板，2.0ul；加去离子水至50ul；所述荧光定量pcr扩增的反应条件包括：94℃5min；94℃15s、58℃45s，共40循环。

本发明所述的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针在对样品中的ki多瘤病毒相应基因进行检测中的应用。

本发明所述的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针在基于荧光定量pcr技术的检测中的应用。

有益效果：本发明能够快速、准确、高效地检测出样品中的人ki多瘤病毒，具有较高的灵敏度和特异性。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的引物和探针如果制备成相应的试剂盒，可以广泛用于临床疾病的诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与食品检疫、流行病学调查等方面。

(2)本发明对kipyv病毒中的vp1基因进行成功表达，并将纯化的抗原结合westernblot和elisa技术，建立了该病毒的蛋白质水平检测体系。检测可用于临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查等。

(3)本发明的目的是通过已报道的kipyv病毒基因序列，选取vp1基因中约193bp片断，设计引物和检测探针，建立kipyv病毒的荧光定量pcr检测方法。

(4)本发明的一套引物和探针，可以通过荧光定量pcr反应对样品中的人ki多瘤病毒进行检测，具有较高的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为人ki多瘤病毒基因片段重组质粒的10倍梯度稀释液(5.0x101～5.0x107拷贝/ml)作为标准模板进行荧光定量pcr扩增的结果图；

图2为ki多瘤病毒荧光定量pcr标准曲线图；

图3为ki多瘤病毒荧光定量pcr检测临床样本的结果图。

具体实施方式

为了进一步说明一套检测人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

本发明的一种人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针，所述上游引物具有seqidno.1的核苷酸序列；

所述下游引物具有seqidno.2的核苷酸序列；

所述探针具有seqidno.3的核苷酸序列。

具体的说，本发明内容是这样实现的：

根据genbank上人ki多瘤病毒全基因组序列(eu433556)，应用vectorntisuite9、primer5.0等程序设计检测vp1基因的引物和taqman探针。

所述的引物和探针长度在20-30碱基之间。

所述的引物和探针序列5’或3’末端化学标记(修饰)不同的基团。

所述的探针5’端标记fam或其他荧光基团，3’端标记tamra或其他荧光淬灭基团。

本发明的一种人ki多瘤病毒的试剂盒，包括所述的引物、探针和fret-pcr标准品。

本发明的一种人ki多瘤病毒的的荧光定量pcr扩增体系，所述的荧光定量pcr反应扩增体系：10×buffer，5.0ul；mg2+，3.5mm；dntp，200um；上下游引物均为0.2um；tanman探针，50nm；taq酶，1.25u；模板，2.0ul；加去离子水至50ul；所述荧光定量pcr扩增的反应条件包括：94℃5min；94℃15s、58℃45s，共40循环。

本发明所述的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针在对样品中的ki多瘤病毒相应基因进行检测中的应用。

本发明所述的人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针在基于荧光定量pcr技术的检测中的应用。

实施例1

荧光定量pcr检测人呼吸道感染ki多瘤病毒

1引物和探针的特异性

引物和探针的特异性是本实验建立的检测方法中最重要的因素。根据genbank中人ki多瘤病毒序列，选取vp1特异性基因设计引物和探针，通过blast比对，结果显示无论是设计的引物还是检测探针的序列均具有很高的特异性，完全达到检测人ki多瘤病毒的要求。

2建立标准曲线的结果

将重组的人ki多瘤病毒重组质粒进行10倍梯度稀释成5.0x101～5.0x107拷贝/ml个浓度后，进行定量pcr扩增。检测的灵敏度可达到5.0x101拷贝/ml，将阳性梯度的模板浓度和对应的ct值进行标准曲线的计算，标准曲线为y＝-2.264×lgx+36.879；其中y：对应的ct值；x：标本的拷贝数。通过标准曲线可以将未知样本中的人ki多瘤病毒进行定量测定。标准曲线的扩增见附图1；图1为人ki多瘤病毒基因片段重组质粒的10倍梯度稀释液(5.0x101～5.0x107拷贝/ml)作为标准模板进行荧光定量pcr扩增的结果图；1-7号分别为5.0x101～5.0x107拷贝/ml，对应的ct值分别为22、24、27、30、33、36、39；

标准曲线的计算结果见附图2。图2为ki多瘤病毒荧光定量pcr标准曲线图；标准曲线为y＝-2.264×lgx+36.879；y：对应的ct值；x：标本的拷贝数。

3临床样本的检测结果

分别对样本吸痰组和样本咽拭子组进行定量pcr检测，结果显示样本咽拭子均无阳性结果出现，而样本吸痰组的检测结果中，有5例阳性结果，检测的阳性率达到0.04％，5例样本编号分别为wl108、wl102、wl211、wl223、wl226，通过标准曲线对检测的模板进行定量，结果感染人博卡病毒的浓度分别为3.95x109、1.46x107、6.95x105、6.94x105、5.45x104。定量pcr扩增结果见附图3，图3为ki多瘤病毒荧光定量pcr检测临床样本的结果图。图3中样本编号为wl108、wl102、wl211、wl223、wl226对应的ct值分别为19、24、27.5、27.5、29。感染人ki多瘤病毒阳性病例的临床症状和相关信息见表1所示。

表1

实施例2

1临床样本收集及模板的制备

本实验共收集9870例临床样本，分别来自温岭市第一人民医院儿科住院患儿的吸痰或咽拭子，对其根据样本的来源类型进行分类，分为样本吸痰组和样本咽拭子组。将吸痰的样本用3倍体积的naoh消化，离心取上清，-20℃保存，待用；咽拭子的样本用pbs缓冲液清洗后，10000rpm离心5分钟，弃上清，加入去离子水，煮沸10分钟，10000rpm离心3分钟，取上清，保存，待用。

实验所用的酶和其他分子生物学拭剂均购自宝生物(大连)有限公司；荧光定量pcr仪使用pe公司5700。

2引物和探针的设计

根据genbank上人ki多瘤病毒全基因组序列(eu433556)，选取vp1基因设计引物和taqman探针，引物和探针的合成均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所九室合成，引物和探针的序列见表2。

表2

3荧光定量pcr扩增

pcr反应扩增体系：10×buffer，5.0ul；mg2+，3.5mm；dntp，200um；上下游引物均为0.2um；tanman探针，50nm；taq酶，1.25u；模板，2.0ul；加去离子水至50ul。pcr反应为：94℃5min；94℃15s、58℃45s，共40循环。

4标准曲线的建立

将人ki多瘤病毒vp2基因克隆重组到veroe6非洲绿猴肾中中，计算出初始拷贝数，然后进行10倍梯度稀释成5.0x101～5.0x107拷贝/ml。pcr扩增反应条件同上。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110>北京博奥森生物技术有限公司

<120>一种人ki多瘤病毒的荧光定量pcr引物和探针及其应用

<130>2018

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物序列artificialsequence)

<400>1

gctaacaaggccaagaagtacag23

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(引物序列artificialsequence)

<400>2

gctagtacttctacccctccttttttt27

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(引物序列artificialsequence)

<400>3

ccccgggtacaaactctggcaacata26