本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及一种多聚体复合物及其制备方法，以及其在t细胞标记、检测、细胞分选或活化中的用途，尤其是一种mhci类的四聚体复合物。
背景技术：
：：t细胞是机体免疫系统最重要的细胞之一，是免疫反应的核心，参与免疫的识别、活化及反应阶段。但是t细胞不能直接识别游离的抗原，抗原必需经过抗原提呈细胞(如巨噬细胞)处理后，以小肽或其他小分子的形式组装到其mhci类或mhcii类的分子上，并且表达在抗原提呈细胞的膜表面。如此形成的mhc-肽复合物才能被t细胞的抗原受体(tcr)结合，从而产生识别和活化。但是mhc-肽与t细胞上的tcr的结合是十分短暂的，天然情况下，还需要apc及t细胞上的辅助黏附分子来加强这种结合，基本无法检测抗原特异性的t细胞，阻碍了t细胞的研究和应用。近年来，出现了mhc-肽的多聚体技术，此技术提高了mhc-肽与t细胞上的tcr的结合的稳定性，对t细胞的检测、分选、活化或扩增具有及其重大的意义。多聚体，例如，专利cn101298478b公开了从i类mhc重组蛋白类似物形成的多聚体，所述的蛋白包含重链与t淋巴细胞cd8共同受体作用区中的至少一个改变，所述多聚体与抗原性肽形成复合物，可用于诊断和治疗目的。专利cn1708512a公开了一种嵌合mhc蛋白及包含至少两种嵌合蛋白的寡聚mhc复合物，所述嵌合蛋白包含来自一种mhc肽链或其功能性部分和来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域。专利cn101111520a公开了mhc寡聚体及其制备方法，所述的mhc寡聚体包含至少两个具有肽结合沟的功能性mhc复合物，每个mhc复合物都具有结合于所述复合物的肽结合沟内的肽，其中每个肽都具有容许所述功能性mhc复合物通过一核心结构发生高度特异性寡聚化的修饰。专利cn106397549a公开了三种mers-cov特异性多肽，并且用相应多肽制备了mhc-四聚体。mhc多聚体的制备方法，例如，专利cn105884870a公开了一种o型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法，首先设计口蹄疫病毒多肽，采用elispot和构建四聚体两种方法筛选和鉴定口蹄疫病毒多肽，构建荷兰猪sla-2重链四聚体。专利cn05884869a公开了一种亚洲i型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法。专利cn1511850a公开了一种mhc-肽抗体多聚体的制备方法，通过制备纯化的mhci类分子的重链和轻链，把纯化产物注射到动物体内使其产生抗体，纯化后标记上荧光标记物再把标记的抗体与新工艺制备的mhc-肽单聚体混合，聚合成为mhc-肽抗体多聚体。该方法简化了多聚体的制备步骤，提高了生产效率，但是多聚体的特异性不高。因此，本发明提供了一种全新的mhci类的四聚体复合物及其制备方法。该四聚体复合物稳定、结构高度均匀，同时特异性高。技术实现要素：本发明的第一方面，涉及一种多聚体复合物，包括：1)单体，所述单体包括mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链，或者，所述单体包括mhc分子α链胞外区和mhc分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。优选的，本发明涉及一种多聚体复合物，包括：1)单体，所述单体包括在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链，或者，所述单体包括在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和mhc分子β链；2)生物素分子；3)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。优选的，所述的mhc分子α链胞外区的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述的mhc分子β2m链的氨基酸序列如seqidno：2所示。为提高多聚体复合物与tcr结合的特异性，所述的单体还包括至少一个氨基酸的化学修饰、突变、插入和/或缺失。优选的，所述的多聚体复合物，还包括抗原肽。优选的，所述的多聚体复合物中所述的mhc分子为mhci类分子或mhcii类分子，更优选的，所述的mhc分子为mhci类分子。优选的，所述mhc分子α链胞外区的第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。优选的，所述mhc分子α链胞外区为hla-a、hla-b或hla-c的α链胞外区。优选的，所述mhc分子α链胞外区的氨基酸序列为seqidno：1(a*0201)所示氨基酸序列或包含与seqidno：1所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个优选的技术方案中，所述mhc分子α链胞外区的氨基酸序列为seqidno：12、13或14(a*0201)所示氨基酸序列或包含与seqidno：12、13或14所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述mhc分子β2m链的氨基酸序列是包含seqidno：2所示氨基酸序列或包含与seqidno：2所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述mhcii类分子为hla-dr、hla-dq或hla-dp的α和β链。优选的，所述抗原肽选自源自epstein-barr病毒的蛋白质或源自巨细胞病毒的蛋白质，或肿瘤相关蛋白。优选的，所述源自epstein-barr病毒的蛋白质为源自epstein-barr病毒的lmp2、lmp1、ebna1、ebna3、bmlf1、brlf1、balf4蛋白质，所述源自巨细胞病毒的蛋白质为巨细胞病毒的pp65、ie1、pp50蛋白质，所述肿瘤相关蛋白为p53等。优选的，所述mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链为非共价缔合或共价连接。进一步优选的，所述共价连接为经由二硫键连接。优选的，所述多聚体复合物至少包含一个单体。在本发明的一个具体实施方式中，所述多聚体复合物包含四个单体，所述多聚体复合物为四聚体复合物。优选的，每个单体至少偶联一个生物素分子。优选的，所述生物素分子与所述单体之间通过短肽标签偶联。进一步优选的，所述短肽标签在所述mhc分子α链胞外区氨基酸序列的c端；更进一步优选的，所述短肽标签为avi-tag，所述avi-tag序列包含glndifeaqkiewhe(seqidno：3)所示氨基酸序列或包含与seqidno：3所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。更优选的，所述的在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区的氨基酸序列如seqidno：15所示。本发明的第二方面，涉及一种单体，所述单体包括在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链，或者，所述单体包括在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和mhc分子β链。优选的，所述的mhc分子α链胞外区的氨基酸序列如seqidno：1所示。更优选的，所述的在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区的氨基酸序列如seqidno：15所示。优选的，所述的mhc分子β2m链的氨基酸序列如seqidno：2所示。优选的，所述的单体还包括至少一个氨基酸的化学修饰、替换、插入和/或缺失。优选的，所述的单体可连接抗原肽。优选的，所述的单体中所述的mhc分子为mhci类分子或mhcii类分子。优选的，所述mhc分子α链胞外区第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。优选的，所述mhc分子α链胞外区为hla-a、hla-b或hla-c的α链胞外区。优选的，所述mhc分子α链胞外区的氨基酸序列为seqidno：1所示氨基酸序列或包含与seqidno：1所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个优选的技术方案中，所述mhc分子α链胞外区的氨基酸序列为seqidno：12、13或14(a*0201)所示氨基酸序列或包含与seqidno：12、13或14所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述mhc分子β2m链的氨基酸序列是包含seqidno：2所示氨基酸序列或包含与seqidno：2所示氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。优选的，所述mhcii类分子为hla-dr、hla-dq或hla-dp的α和β链。优选的，所述抗原肽选自源自epstein-barr病毒的蛋白质或源自巨细胞病毒的蛋白质，或肿瘤相关蛋白。优选的，所述源自epstein-barr病毒的蛋白质为源自epstein-barr病毒的lmp2、lmp1、ebna1、ebna3、bmlf1、brlf1、balf4蛋白质，所述巨细胞病毒的蛋白质为巨细胞病毒的pp65、ie1、pp50蛋白质，所述肿瘤相关蛋白为p53等。优选的，所述mhc分子α链胞外区和mhc分子β2m链为非共价缔合或共价连接。进一步优选的，所述共价连接为经由二硫键连接。本发明的第三方面，涉及一种编码上述单体的核酸；优选的，所述核酸包含编码所述mhc分子α链胞外区和/或mhc分子β2m链的核苷酸序列。优选的，所述核酸包含编码所述在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和/或mhc分子β2m链的核苷酸序列。优选的，编码所述mhc分子α链胞外区的核苷酸序列是包含seqidno：4所示核苷酸序列或包含与seqidno：4所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。优选的，所述核酸包含编码所述在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区序列是包含seqidno：16所示核苷酸序列或包含与seqidno：16所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。编码所述mhc分子β2m链的核苷酸序列是包含seqidno：5所示核苷酸序列或包含与seqidno：5所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。优选的，编码所述mhc分子β2m链的核苷酸序列是包含seqidno：20所示核苷酸序列或包含与seqidno：20所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。相比于seqidno：5，seqidno：20带有ompa的信号肽，该信号肽会在形成成熟蛋白质时自然切除。本发明的第四方面，涉及一种包含上述核酸的载体。优选的，所述载体为质粒。在本发明的一个具体实施方式中，所述载体为pet28a+。本发明的第五方面，涉及一种包含上述的载体的表达菌。在本发明的一个具体实施方式中，所述表达菌为transetta(de3)和/或bl21。本发明的第六方面，涉及一种多聚体复合物的制备方法，包括如下步骤：(1)表达和纯化在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和/或mhc分子β2m链；(2)将步骤(1)获得的在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区和/或mhc分子β2m链稀释复性，制备单体，其中，所述在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区与mhc分子β2m链的摩尔比为(2-2.5):1；(3)将步骤(2)制备的单体生物素化，获得生物素化的单体；(4)将步骤(3)获得的经生物素化的单体与带标记的链霉亲和素反应，制备多聚体复合物，其中，所述单体与所述链霉亲和素反应的摩尔比为(4-7):1。在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(2)中所述在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区与mhc分子β2m链的摩尔比为2:1。优选的，所述步骤(4)中所述单体与所述链霉亲和素反应的摩尔比为(5.5-6):1。在本发明的一个具体实施方式中，所述多聚体复合物为四聚体复合物。优选的，所述的单体中所述的mhc分子为mhci类分子或mhcii类分子。优选的，所述mhc分子α链胞外区第245位氨基酸残基为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。优选的，所述步骤(1)中包括分别克隆编码在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区的核苷酸序列和编码mhc分子β2m链的核苷酸序列，并将克隆后的序列连接在载体上；将连接有编码在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区的核苷酸序列和编码mhc分子β2m链的核苷酸序列的载体转化到表达菌中培养，加入诱导剂，提取包涵体。在本发明的具体实施方式中，所述步骤(1)包括克隆在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区，并装在载体上。克隆mhc分子β2m链对应的cdna序列，并在cdna序列对应的第一个氨基酸前面连接信号肽序列，所述信号肽序列为ompa信号肽序列，并将连接有信号肽序列的cdna序列连接在载体上。其中，avi-tag的核苷酸序列如5’-ggtttgaacgacatcttcgaagctcagaaaatcgaatggcacgaataa-3’(seqidno：6)所示。优选的，所述载体为质粒。在本发明的一个具体实施方式中，所述载体为pet28a+。优选的，所述表达菌为transetta(de3)和/或bl21。优选的，所述表达菌的培养至od600值在0.2-0.4之间；所述诱导剂加入后的最终摩尔浓度为0.5-1.0mm。优选的，提取包涵体包括重悬菌体细胞、向菌体中加入溶菌酶、裂解菌体、洗涤、将菌体裂解物在液氮中速冻直至液体变白固化，随后溶解固化的菌体裂解物、离心去上清、洗涤、离心去上清。优选的，所述步骤(2)包括mhc分子β2m链的复性折叠及将抗原肽、mhc分子β2m链、在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区依次加入稀释缓冲液中避光水浴，其中，所述的mhc分子β2m链的复性折叠包括包涵体变性、加入蛋白酶抑制剂，而后透析；优选的，所述透析液为6m尿素，75mmtris-hcl(ph8)；4m尿素，50mmtris-hcl(ph8)；2m尿素，25mmtris-hcl(ph8)；及10mmtris-hcl(ph7.4)；所述步骤(2)中还包括纯化单体，所述纯化单体选用superdex7510/300gl柱子，流速0.5ml/min；压力1.4mpa，上样环2ml。优选的，所述透析过程中透析液分2-6次加入或每个10-14h加入一次。进一步优选的，所述透析过程中透析液分4次加入或每个12h加入一次。优选的，所述抗原肽选自源自epstein-barr病毒的蛋白质或源自巨细胞病毒的蛋白质，或肿瘤相关蛋白。优选的，所述源自epstein-barr病毒的蛋白质为源自epstein-barr病毒的lmp2、lmp1、ebna1、ebna3、bmlf1、brlf1、balf4蛋白质，所述巨细胞病毒的蛋白质为巨细胞病毒的pp65、ie1、pp50蛋白质，所述肿瘤相关蛋白为p53等。优选的，所述步骤(3)的生物素化是在bira酶的催化下，将单体与biomixa、biomixb结合；所述步骤(3)中还包括纯化生物素化的单体，纯化生物素化的单体选用superdex7510/300gl柱子，流速0.5ml/min；压力1.4mpa，上样环500μl。本发明的第七方面，涉及上述的多聚体复合物、上述的单体、上述核酸或上述的载体在t细胞标记、检测、细胞分选或活化中的用途。本发明的第八方面，涉及一种根据抗原受体特异性来标记或检测t细胞的方法，包括：(1)将本发明所述的多聚体复合物与包含t细胞的悬浮液或生物学样品混合在一起；(2)检测本发明所述的多聚体复合物与t细胞的特异性结合的存在。本发明的第九方面，涉及一种根据抗原受体特异性分选t细胞的方法，包括：(1)将本发明所述的多聚体复合物与包含t细胞的悬浮液或生物学样品混合在一起；(2)将结合到本发明所述的多聚体复合物的t细胞从未结合的细胞中分选出来。本发明的第十方面，涉及一种根据抗原受体特异性进行t细胞活化的方法，包括将本发明所述的多聚体复合物与包含t细胞的悬浮液或生物学样品接触。本发明所述的“同源性”是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：图1：质粒图谱，其中，图a为构建完成的pet28a+α链的质粒图谱，图b为构建完成的pet28a+β2m链的质粒图谱；图2：α链、β2m链的westernblot分析结果，其中图a为α链全长和胞外区(1-276氨基酸)的蛋白表达对比结果，图b为β2m链不同信号肽对蛋白表达的影响；图3：α链、β2m链的western结果的量化图；图4：单体和生物素化的单体的sdspage结果图；图5：多聚体分选特异性t细胞的结果；图6：多聚体分选特异性t细胞的一致性和稳定性结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实验材料与试剂1、菌体transetta(de3)：cat.no.cd801-02,transgen；(transetta(de3)chemicallycompetentcell)2、dnasei：cat.no.dn25-100mg,sigma-aldrich；3、蛋白酶抑制剂：cat.no.4693116001,roche；4、l-精氨酸盐酸盐：cat.no.a6969,sigma-aldrich；5、还原型谷胱甘肽：cat.no.g6529,sigma-aldrich；6、氧化型谷胱甘肽：cat.no.g4626,sigma-aldrich；7、edta：cat.no.e9884,sigma-aldrich；8、溶菌酶：cat.no.0663-5g,amresco；9、脱氧胆酸：cat.no.d5670,sigma-aldrich；10、bira生物素蛋白连接酶：cat.no.bira500,avidity；11、链霉亲和素-apc：cat.no.85-17-4317-82,ebioscience；12、透析管：cat.no.aov80084,biodee；13、截留分子量为3kda的透析袋：cat.no.ufc900396,merckmillipore；14、截留分子量为30kda的透析袋：cat.no.ufc903024,merckmillipore；15、裂解缓冲液：50mmtris-hcl(ph8)，25％蔗糖，1mmedta；16、去垢剂缓冲液：0.2mnacl，1％去氧胆酸，1％np40，20mmtris-hcl(ph7.4，2mmedta)；17、洗涤缓冲液：20mmtrisph8，100mmnacl；18、变性缓冲液：8m尿素，100mmtris-hcl(ph8)；19、交换缓冲液：20mmtris-hcl(ph7.4),150mmnacl。实施例1人mhci类分子重链(α链)和轻链(β2m链)的表达一、实验步骤1、质粒构建人mhci类分子重链(α链)全长对应的cdna序列(seqidno：18)的克隆或者α链胞外区对应的cdna序列(seqidno：4)的克隆，在此序列的c端连接avi-tag序列(seqidno：6)，并用bamhi酶切位点相连，得到在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区编码序列(seqidno：16)。将在c端连接avi-tag序列的mhc分子α链胞外区编码序列或者α链全长编码序列连接到pet28a+载体上，位于酶切位点ncoi和xhoi之间。为提高mhci类分子与tcr结合的特异性，α链第245位丙氨酸(alanine)突变成缬氨酸(valine)。克隆在n端连接ompa的信号肽编码序列(seqidno：11)的β2m链cdna序列(seqidno：5)，得到seqidno：20；或者，克隆带自身信号肽的β2m链的cdna序列(seqidno：19)，将以上序列分别连接到pet28a+载体的ncoi和xhoi两个酶切位点之间。构建完成的质粒图谱见图1，其中，图1a为构建完成的pet28a+α链的质粒图谱，显示了c端连接avi-tag序列的α链胞外区序列，图1b为构建完成的pet28a+β2m链的质粒图谱，显示了在n端连接ompa的信号肽编码序列的β2m链序列。扩增α链的引物序列：e-a0201-f:ctttaagaaggagatataccatgggctctcactccatg(seqidno：7)e-a0201-r:cagtggtggtggtggtggtgctcgagttattcgtgccattcg(seqidno：8)扩增β2m链的引物序列：ompa-b2m-f:ctttaagaaggagatataccatggccaaaaagacagctatcgcg(seqidno：9)ompa-b2m-r:cagtggtggtggtggtggtgctcgagttacatgtctcgatcccac(seqidno：10)2、将载有α链和β2m链的载体分别转化到表达菌transetta(de3)或bl21中，使其在含有抗生素卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的lb平板上生长过夜。3、挑选克隆溶于20μl带抗生素的lb培养基，取2μl用于菌落pcr，剩余的18μl加入到10ml带抗生素的培养基，37℃，250rpm/min，摇菌大约6h。得到od600约为0.8的菌液。4、将10ml菌液按1：100接入1l带抗生素的lb培养基中，37℃，250rpm/min，摇菌大约2h，至od600到0.2-0.4。取40μl菌液，与10μl上样缓冲液(loadingbuffer)混匀煮沸10min，用做表达前的0h对照，做sds-page分析。5、取出5ml菌液放入15ml管中，不加诱导剂，作为诱导表达结束时的对照。向余下的1l菌液中加入0.5或1mliptg，1m，iptg的终浓度为0.5或1mm。6、37℃，250rpm/min，诱导表达4-6小时。分别从5ml的对照管和1l的表达组取40μl菌液用于sdspage分析。7、离心菌液，4℃，4000g，20min。去除上清。沉淀可于-20℃保存，或直接提取包涵体。8、称取菌体质量，1l菌液大概得到3-5g细胞。9、加入8mllysisbuffer，重悬菌体细胞。10、将20mg溶菌酶溶于2mllysisbuffer。11、将含有溶菌酶的lysisbuffer加入到8ml的菌体裂解物中，冰上孵育30min。12、加入100μlmgcl2(1m)，100μlmncl2(100mm)和50μldnasei储液(10mg/ml)。dnasei储液含有50％甘油，150mmnacl，保存于-20℃。13、冰上孵育30min。14、加入20mldetergentbuffer。15、将裂解物转入50ml离心管，在液氮中速冻，直至液体变白固化，可于-80℃保存。16、将管子室温放置5min，再于37℃水浴溶解。17、离心裂解物，4℃，14000g，20min。18、去除上清。19、用washbuffer洗沉淀。先加5ml，重悬沉淀，并用0.6-0.8mm针头的注射器反复吹吸，使沉淀均匀重悬，补加washbuffer至30ml。20、重复17-19步。21、4℃，14000g，20min。重悬沉淀，溶于20mlwashbuffer，分装到1.5ml管，每管1ml。22、4℃，16000g离心5min，去除上清，得包涵体。沉淀储存于-80℃。二、实验结果α链、β2m链的westernblot分析结果见图2。其中，采用对比试验比较了α链全长(氨基酸序列如seqidno：17)和α链胞外区(1-276氨基酸，第245位氨基酸残基为缬氨酸)的蛋白表达情况和β2m链不同信号肽(带有自身信号肽的β2m的核苷酸序列如seqidno：19；带有ompa的信号肽的β2m的核苷酸序列如seqidno：20)对蛋白表达的影响。为便于检测，在c端连接his-tag，用抗his蛋白的抗体检测蛋白表达。在单体及多聚体形成的实验中所用的α链和β2m链去掉his-tag。α链、β2m链的western结果的量化见图3。其中，α链的1、2、3、4分别代表α链全长用bl21表达、α链全长用transetta(de3)表达、α链胞外区用bl21表达、α链胞外区用transetta(de3)表达。β2m链的1、2、3、4分别代表带自身信号肽的β2m链用bl21表达、带自身信号肽的β2m链用transetta(de3)表达、带ompa信号肽的β2m链用bl21表达、带ompa信号肽的β2m链用transetta(de3)表达。图中transetta代表transetta(de3)。由此图可以看出，不管是表达α链还是β2m链，表达菌transetta(de3)明显优于表达菌bl21，α链胞外区的表达明显优于全长序列的表达，带有ompa信号肽的β2m链的表达明显优于带有自身信号肽序列的表达。纵坐标显示倍数关系。实施例2人mhci单体的折叠和纯化一、人β2m链复性折叠其中β2m链氨基酸序列如seqidno：2：iqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm所示。1、将1l菌液所得的包涵体溶于10mldenaturingbuffer；4℃，16000g离心5min。2、取上清，加denaturingbuffer至终体积为50ml；加入半片蛋白酶抑制剂，溶于0.5mldenaturingbuffer中。3、将步骤2得到的溶液置于透析袋中(截留分子量为3kda)，于1ldialysisbuffer透析48小时，每12小时换一次透析液。透析液为：6m尿素，75mmtris-hcl(ph8)；4m尿素，50mmtris-hcl(ph8)；2m尿素，25mmtris-hcl(ph8)；10mmtris-hcl(ph7.4)。得到10-15ml50μm折叠好的β2m。二、人mhci单体的折叠和纯化实验所用的α链胞外区如seqidno：1所示，我们也同时完成了12、13或14所示的其他α链胞外区序列。1、准备新鲜配制的稀释缓冲液(dilutionbuffer)，具体配方、加入量及终浓度见表1，并置于冰上。表1dilutionbuffer的配方、加入量及终浓度试剂加入量终浓度1mtris-hcl(ph8)5ml100mml-精氨酸盐酸盐4.2g400mm100mm还原型谷胱甘肽2.5ml5mm50mm氧化型谷胱甘肽0.5ml0.5mm0.5medta0.2ml2mmedta蛋白酶抑制剂1tableth2o(milli-q)41.8ml2、取1管c端连接avi-tag序列的α链胞外区的包涵体先溶于200μldenaturingbuffer，重悬，补加800μl；4℃，16000g离心2min。3、取上清置于新的1.5ml管中。用bca试剂盒测蛋白浓度。4、将抗原肽、β2m链和c端连接avi-tag序列的α链胞外区按顺序加入dilutionbuffer中：1)取2mg多肽溶于200μldmso，加入dilutionbuffer，终浓度40μm，混匀。2)加入1.2mgβ2m，终浓度2μm，混匀。3)加入1.65mgc端连接avi-tag序列的α链胞外区蛋白，终浓度1μm，混匀。5、10℃避光水浴72h。用截留分子量为30kda的超滤管浓缩蛋白至体积为2ml，3500rpm，多次离心10min。6、通过凝胶过滤层析纯化mhci单体。选用superdex7510/300gl柱子，流速0.5ml/min；压力1.4mpa，上样环2ml。exchangebuffer为20mmtris-hcl(ph7.4)，150mmnacl。收集产物单体，于4℃保存。各样品取10μl用于sdspage分析。三、实验结果单体的sdspage结果见图4。m代表蛋白marker，1代表单体。如图所示，经过复性折叠和hplc纯化，得到的单体清晰地显示重链和轻链对应大小的蛋白，且纯度较高。，实施例3四聚体的制备一、mhci单体的生物素化1、使用avidity的试剂盒进行生物素化表2avidity的试剂盒的配方2、反应可以置于4℃过夜反应。通过凝胶过滤层析纯化生物素化的mhci单体。选用superdex7510/300gl柱子，流速0.5ml/min；压力1.4mpa，上样环500μl。exchangebuffer为20mmtris-hcl(ph7.4)，150mmnacl。收集生物素化的单体，于4℃保存。各样品取10μl用于sdspage分析。3、一个链霉亲和素可以结合4个mhci单体，为确保链霉亲和素饱和结合mhci单体，mhc单体与链霉亲和素的摩尔比为6：1。具体为：17μg的mhc单体(50μl，0.34mg/ml)结合10μg的链霉亲和素-apc(50μl，0.2mg/ml)。将50μl链霉亲和素-apc分4次，每次间隔15min加入到50μlmhci单体中，形成四聚体。通过凝胶过滤层析分析mhci四聚体。选用superose6increase5/150gl柱子，流速0.15ml/min；压力3.5mpa，上样环100μl。4、1-2μlmhc四聚体用于染色1×106细胞。二、实验结果生物素化的单体的sdspage结果见图4。m代表蛋白marker，2代表生物素化单体。如图所示，经过生物素化和hplc纯化，得到的生物素化的单体清晰地显示重链和轻链对应大小的蛋白，且纯度非常高。实施例4t细胞特异性检测一、实验步骤1.分离人外周血单核细胞(pbmc)，制备细胞悬液，细胞密度为1χ106细胞/ml。2.将细胞离心，3000rpm，5min。去除上清，用50μl含有1％血清的pbs重悬。3.加入2μl四聚体室温孵育30min。4.加入2μlcd8抗体，冰上孵育20min。5.加入1mlpbs，3000rpm，5min。6.去除上清，加入1mlpbs，3000rpm，5min。7.去除上清，用500μl的4％多聚甲醛重悬细胞，用滤膜过滤细胞悬液。8.用流式细胞仪检测阳性细胞。二、实验结果应用本发明实施例制备的四聚体进行分选特异性t细胞，其结果见图5。其中，pe染色的细胞代表cd8阳性细胞，apc染色的细胞代表四聚体阳性细胞。应用hla-a*0201结合了cmvpp65抗原肽的四聚体筛选特异性t细胞，与商业化四聚体相比，本发明实施例中自主研发的四聚体对特异性t细胞的分选实验中，显示出极高的特异性和分选效率。应用本发明实施例制备的四聚体分选特异性t细胞具有高度一致性和稳定性，其结果见图6。其中，fitc染色的细胞代表cd8阳性细胞，apc染色的细胞代表四聚体阳性细胞。应用hla-a*2402结合了ebv抗原表位的四聚体分选不同来源的人外周血单核细胞(pbmc)，都能得到特异性的t细胞群，结果高度稳定。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。序列表<110>清华大学、华夏英泰（北京）生物技术有限公司、上海赛傲生物技术有限公司<120>一种多聚体复合物及其制备方法<130>1<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glyserhissermetargtyrphephethrservalserargprogly151015argglygluproargpheilealavalglytyrvalaspaspthrgln202530phevalargpheaspseraspalaalaserglnargmetgluproarg354045alaprotrpilegluglngluglyproglutyrtrpaspglygluthr505560arglysvallysalahisserglnthrhisargvalaspleuglythr65707580leuargglytyrtyrasnglnserglualaglyserhisthrvalgln859095argmettyrglycysaspvalglyserasptrpargpheleuarggly100105110tyrhisglntyralatyraspglylysasptyrilealaleulysglu115120125aspleuargsertrpthralaalaaspmetalaalaglnthrthrlys130135140hislystrpglualaalahisvalalagluglnleuargalatyrleu145150155160gluglythrcysvalglutrpleuargargtyrleugluasnglylys165170175gluthrleuglnargthraspalaprolysthrhismetthrhishis180185190alavalserasphisglualathrleuargcystrpalaleuserphe195200205tyrproalagluilethrleuthrtrpglnargaspglygluaspgln210215220thrglnaspthrgluleuvalgluthrargproalaglyaspglythr225230235240pheglnlystrpvalalavalvalvalproserglyglngluglnarg245250255tyrthrcyshisvalglnhisgluglyleuprolysproleuthrleu260265270argtrpglupro275<210>2<211>99<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ileglnargthrprolysileglnvaltyrserarghisproalaglu151015asnglylysserasnpheleuasncystyrvalserglyphehispro202530seraspilegluvalaspleuleulysasnglygluargileglulys354045valgluhisseraspleuserpheserlysasptrpserphetyrleu505560leutyrtyrthrgluphethrprothrglulysaspglutyralacys65707580argvalasnhisvalthrleuserglnprolysilevallystrpasp859095argaspmet<210>3<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3glyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrphisglu151015<210>4<211>828<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggctctcactccatgaggtatttcttcacatccgtgtcccggcccggccgcggggagccc60cgcttcatcgcagtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgcc120gcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggagggtccggagtattgg180gacggggagacacggaaagtgaaggcccactcacagactcaccgagtggacctggggacc240ctgcgcggctactacaaccagagcgaggccggttctcacaccgtccagaggatgtatggc300tgcgacgtggggtcggactggcgcttcctccgcgggtaccaccagtacgcctacgacggc360aaggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagct420cagaccaccaagcacaagtgggaggcggcccatgtggcggagcagttgagagcctacctg480gagggcacgtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcag540cgcacggacgcccccaaaacgcatatgactcaccacgctgtctctgaccatgaagccacc600ctgaggtgctgggccctgagcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcgggat660ggggaggaccagacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaacc720ttccagaagtgggtggctgtggtggtgccttctggacaggagcagagatacacctgccat780gtgcagcatgagggtttgcccaagcccctcaccctgagatgggagccg828<210>5<211>297<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtca60aatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactg120aagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactgg180tctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgc240cgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatg297<210>6<211>48<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggtttgaacgacatcttcgaagctcagaaaatcgaatggcacgaataa48<210>7<211>38<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctttaagaaggagatataccatgggctctcactccatg38<210>8<211>42<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cagtggtggtggtggtggtgctcgagttattcgtgccattcg42<210>9<211>44<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctttaagaaggagatataccatggccaaaaagacagctatcgcg44<210>10<211>45<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cagtggtggtggtggtggtgctcgagttacatgtctcgatcccac45<210>11<211>60<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc60<210>12<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12glyserhissermetargtyrphephethrservalserargprogly151015argglygluproargpheilealavalglytyrvalaspaspthrgln202530phevalargpheaspseraspalaalaserglnargmetgluproarg354045alaprotrpilegluglngluglyproglutyrtrpaspglygluthr505560arglysvallysalahisserglnthrhisargvalaspleuglythr65707580leuargglytyrtyrasnglnserglualaglyserhisthrvalgln859095argmettyrglycysaspvalglyserasptrpargpheleuarggly100105110tyrhisglntyralatyraspglylysasptyrilealaleulysglu115120125aspleuargsertrpthralaalaaspmetalaalaglnthrthrlys130135140hislystrpglualaalahisvalalagluglnleuargalatyrleu145150155160gluglythrcysvalglutrpleuargargtyrleugluasnglylys165170175gluthrleuglnargthraspalaprolysthrhismetthrhishis180185190alavalserasphisglualathrleuargcystrpalaleuserphe195200205tyrproalagluilethrleuthrtrpglnargaspglygluaspgln210215220thrglnaspthrgluleuvalgluthrargproalaglyaspglythr225230235240pheglnlystrpalaalavalvalvalproserglyglngluglnarg245250255tyrthrcyshisvalglnhisgluglyleuprolysproleuthrleu260265270argtrpglupro275<210>13<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13glyserhissermetargtyrphephethrservalserargprogly151015argglygluproargpheilealavalglytyrvalaspaspthrgln202530phevalargpheaspseraspalaalaserglnargmetgluproarg354045alaprotrpilegluglngluglyproglutyrtrpaspglygluthr505560arglysvallysalahisserglnthrhisargvalaspleuglythr65707580leuargglytyrtyrasnglnserglualaglyserhisthrvalgln859095argmettyrglycysaspvalglyserasptrpargpheleuarggly100105110tyrhisglntyralatyraspglylysasptyrilealaleulysglu115120125aspleuargsertrpthralaalaaspmetalaalaglnthrthrlys130135140hislystrpglualaalahisvalalagluglnleuargalatyrleu145150155160gluglythrcysvalglutrpleuargargtyrleugluasnglylys165170175gluthrleuglnargthraspalaprolysthrhismetthrhishis180185190alavalserasphisglualathrleuargcystrpalaleuserphe195200205tyrproalagluilethrleuthrtrpglnargaspglygluaspgln210215220thrglnaspthrgluleuvalgluthrargproalaglyaspglythr225230235240pheglnlystrpilealavalvalvalproserglyglngluglnarg245250255tyrthrcyshisvalglnhisgluglyleuprolysproleuthrleu260265270argtrpglupro275<210>14<211>276<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14glyserhissermetargtyrphephethrservalserargprogly151015argglygluproargpheilealavalglytyrvalaspaspthrgln202530phevalargpheaspseraspalaalaserglnargmetgluproarg354045alaprotrpilegluglngluglyproglutyrtrpaspglygluthr505560arglysvallysalahisserglnthrhisargvalaspleuglythr65707580leuargglytyrtyrasnglnserglualaglyserhisthrvalgln859095argmettyrglycysaspvalglyserasptrpargpheleuarggly100105110tyrhisglntyralatyraspglylysasptyrilealaleulysglu115120125aspleuargsertrpthralaalaaspmetalaalaglnthrthrlys130135140hislystrpglualaalahisvalalagluglnleuargalatyrleu145150155160gluglythrcysvalglutrpleuargargtyrleugluasnglylys165170175gluthrleuglnargthraspalaprolysthrhismetthrhishis180185190alavalserasphisglualathrleuargcystrpalaleuserphe195200205tyrproalagluilethrleuthrtrpglnargaspglygluaspgln210215220thrglnaspthrgluleuvalgluthrargproalaglyaspglythr225230235240pheglnlystrpleualavalvalvalproserglyglngluglnarg245250255tyrthrcyshisvalglnhisgluglyleuprolysproleuthrleu260265270argtrpglupro275<210>15<211>293<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15glyserhissermetargtyrphephethrservalserargprogly151015argglygluproargpheilealavalglytyrvalaspaspthrgln202530phevalargpheaspseraspalaalaserglnargmetgluproarg354045alaprotrpilegluglngluglyproglutyrtrpaspglygluthr505560arglysvallysalahisserglnthrhi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