本发明涉及一种菌株的分离方法及所述菌株的固结砂土的方法，尤其涉及一种沙漠自源矿化菌株的分离方法、所述菌株的矿化能力的验证方法、所述菌株在诱导碳酸钙沉淀固结砂土中的应用、所述菌株诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法。
背景技术
土壤是微生物最适宜的生存环境，是微生物的“天然培养基”，微生物生长繁殖及其代谢活动造成矿物元素运移、富集，以及微生物在沉积物的成岩、成矿作用中起着重要的作用。有机物丰富的土壤为微生物创造了一个较为有利的生存环境，促使微生物分泌出可以将土颗粒粘结在一起的矿化物质，而这种微生物矿化作用同样被广泛应用岩土工程领域，将生物工程与岩土工程相结合来修复与改良土壤环境。
目前，国内东南大学钱春香《一种利用磷酸盐矿化菌固结松散砂颗粒》(zl201310205389.9)公开了通过将磷酸苯二钠加入利用枯草芽孢杆菌菌液得到磷酸盐矿化菌，将松散砂颗粒胶结成整体；方祥位《利用微生物固化松散珊瑚砂的方法》(zl20140050192.7)公开了利用巴氏芽孢杆菌固化松散珊瑚砂的方法。在岩土工程领域中，以上固化方法中主要采用巴氏芽孢杆菌，均取得了较好的成果，但目前微生物固化方法中使用的菌种较为单一，沙漠风沙土中微生物种类繁多，可从中筛选其它具有矿化能力的菌种。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提出一种沙漠自源矿化菌株的分离方法、所述菌株的矿化能力的验证方法、所述菌株在诱导碳酸钙沉淀固结砂土中的应用、所述菌株诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法。
本发明采用以下技术方案实现：一种沙漠自源矿化菌株的分离方法，从内蒙古沙漠中取地表30～50cm下的风沙土，放入液体培养基中振荡，制备成不同浓度的稀释溶液，分别涂布于固体培养基上，进行恒温培养，挑取单菌落反复划线，纯化培养3-5次，直至出现单菌落并选为所述沙漠自源矿化菌株；
其中，所述液体培养基由10～15g酵母粉、0.01～0.1molch3coona、0.05～0.1molnh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2组成；所述固体培养基由10～15g酵母粉、0.01～0.1molch3coona、0.05～0.1mol0.1nh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2、15～20g/l琼脂粉组成。
作为上述方案的进一步改进，风沙土放入液体培养基中振荡为：
所述风沙土放入液体培养基中振摇15～60min后静置24h；
取上清液接种至新的所述液体培养基中，振荡温度30℃～35℃，150～200r/min，ph6.0～7.0，培养时长2d～3d，反复振荡培养3次；
梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的土壤溶液作为所述不同浓度的稀释溶液。
作为上述方案的进一步改进，恒温培养为：不同浓度的稀释溶液分别涂布于上表面具有固体培养基的平板上30℃～35℃恒温培养2d～3d。
进一步地，所述平板放入恒温培养箱中培养。
作为上述方案的进一步改进，挑取单菌落继续接种至新的所述液体培养基中，用平板培养反复划线分离多次直至平板上出现分散的单菌落，从分散的单菌落中挑选进行纯化得到所述沙漠自源矿化菌株。
本发明还提供一种菌株的矿化能力的验证方法，所述菌株为采用上述任意沙漠自源矿化菌株的分离方法分离出来的沙漠自源矿化菌株；所述验证方法为：将不同的单菌落放入液体培养基中培养2d～3d后，接种1～10ml菌液至营养液中，将出现白色沉淀的混合液静置24h，并由xrd鉴定白色沉淀物质；其中，所述营养液包括3％～6％nutrientbroth、0.4mol～0.7molco(nh2)2、0.25mol～0.5molcacl2.2h2o、0.1mol～0.5molnh4cl、0.01mol～0.1molnahco3。
本发明还提供一种菌株在诱导碳酸钙沉淀固结砂土中的应用，所述菌株为采用上述任意沙漠自源矿化菌株的分离方法分离出来的沙漠自源矿化菌株。
本发明还提供一种菌株诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法，其包括步骤：
选择粒径0.074mm～2mm的砂土，将砂土和菌液混合搅拌均匀制备成砂土试样，并使整个砂土试样浸入营养液中，为菌液中菌株的生长提供所需的营养，使菌株在新陈代谢过程中充分发挥其矿化能力，不断诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒孔隙中，使砂土得到固结；其中，所述菌株为采用如权利要求1至5中任意一项所述的沙漠自源矿化菌株的分离方法分离出来的沙漠自源矿化菌株。
作为上述方案的进一步改进，所述营养液包括3％～6％nutrientbroth、0.4mol～0.7molco(nh2)2、0.25mol～0.5molcacl2.2h2o、0.1mol～0.5molnh4cl、0.01mol～0.1molnahco3。
作为上述方案的进一步改进，当菌液浓度od600为0.6～2.5时，砂土试样强度范围为0.9～4.3mpa。
本发明公开的具有矿化能力的菌株及其在岩土工程中的应用。此菌株为葡萄球菌(staphylococcus)，保藏中心登记号为cgmccno.15633，该菌株gy1#为沙漠风沙土中的自源菌株，此发明还提供了葡萄球菌gy1#诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法，caco3沉淀在砂土颗粒孔隙中，提高砂土颗粒的粘聚力，自源菌株不破坏土壤原有的生态环境，可用于岩土工程中砂土的固化，具有很好的研究和应用前景，并适合大规模推广砂类土壤的结皮与改良。
本发明的有益效果：
1、gy1#即沙漠自源矿化菌株可以作为一种新型固化土壤的微生物菌种，颗粒黏结效果好，固化强度高，有很好的研究和应用价值。
2、gy1#由沙漠风沙土自源筛选分离，适用于砂类土壤的结皮和改良，可避免外源菌种对土壤环境的影响。
生物材料的保藏
本发明所提供的菌株是gy1#，已于2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记号为cgmccno.15633。
附图说明
图1为针对沙漠自源矿化菌株应用nj法构建系统发育树示意图。
图2为采用本发明沙漠自源矿化菌株的分离方法分离的沙漠自源矿化菌株的sem扫描电镜图像。
图3为采用沙漠自源矿化菌株矿化后的砂土试样示意图。
图4为图3中砂土试样的x射线衍射分析图；
图5为图3中砂土试样的sem电镜扫描图像。
图6为图3中砂土试样的能谱分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，所有培养基、溶液中的溶剂均为纯水。
实施例1
本实施例公开一种沙漠自源矿化菌株的分离方法。所述菌株为由内蒙古沙漠风沙土中筛选分离获得，经16srdna测序(见表1)并构建系统发育树，表明此菌株可归属为葡萄球菌属(staphylococcus)(系统发育树见图1)，命名为gy1#。
本发明所提供的菌株gy1#，已于2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏中心登记号为cgmccno.15633。该菌为革兰氏阳性，好氧性菌。
表1
也就是说，对挑选出的具有矿化能力菌株进行16srdna测序及系统发育数的构建。通过扫描电镜可以对挑选出的菌株清晰观察到：菌体大小均匀，为球型或者椭圆形，平均直径为1.2μm～1.5μm，见图2。
16srdna鉴定是利用细菌的16srdna序列测序的方法对细菌进行种属鉴定，本发明中16srdna的序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司进行，测序结果见表1。应用nj法构建系统发育树，见图1，将筛选出的菌株归属为葡萄球菌属(staphylococcus)，命名为gy1#。
所述沙漠自源矿化菌株的分离方法为：从内蒙古沙漠中取地表30～50cm下的风沙土，放入液体培养基中振荡，制备成不同浓度的稀释溶液，分别涂布于固体培养基上，进行恒温培养，挑取单菌落反复划线，纯化培养3-5次，直至出现单菌落并选为所述沙漠自源矿化菌株。
其中，所述液体培养基由10～15g酵母粉、0.01～0.1molch3coona、0.05～0.1molnh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2组成；所述固体培养基由10～15g酵母粉、0.01～0.1molch3coona、0.05～0.1mol0.1nh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2、15～20g/l琼脂粉组成。
在本实施例中，沙漠自源矿化菌株这菌种分离培养与纯化：通过分离纯化技术从混杂的天然微生物中分离出需要的微生物。
通过分离纯化技术从混杂的天然微生物中分离出需要的微生物。从内蒙古沙漠中选地表下30～50cm的砂土，取1-5g放入100ml液体培养基(10～15g酵母粉、0.01～0.1ch3coona、0.05～0.1molnh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2)中充分振摇15～60min后静置24h，取上清液接种至新的液体培养基中，最佳振荡温度30℃～35℃，150～200r/min，ph6.0～7.0，培养时长2d～3d。如此反复振荡培养3次后，梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的土壤溶液，分别涂布于平板(固体培养基：10～15g酵母粉、0.01～0.1molch3coona、0.05～0.1mol0.1nh4cl、0.1～0.5molco(nh2)2、15～20g/l琼脂粉)上30℃～35℃恒温培养2d～3d。挑取单菌落继续接种至新的液体培养基中，用平板培养反复划线分离多次直至平板上出现分散的单菌落，并根据菌落的形状，表面光泽，边缘形状，菌落的颜色的差别，挑选出合适的菌落进行纯化。
实施例2
采用实施例1的沙漠自源矿化菌株的分离方法分离的菌株在诱导碳酸钙沉淀固结砂土中的应用。菌株是用于砂土的改良与固化的微生物，是一种具有矿化能力的细菌，且在岩土工程中提高土的力学性能，具有很好的应用前景，菌株能应用在诱导碳酸钙沉淀固结砂土中。
实施例3
本实施例公开采用实施例1的沙漠自源矿化菌株的分离方法分离的菌株的矿化能力的验证方法，所述验证方法为：将不同的单菌落放入液体培养基中培养2d～3d后，接种1～10ml菌液至营养液中，将出现白色沉淀的混合液静置24h，并由xrd鉴定白色沉淀物质；其中，所述营养液包括3％～6％nutrientbroth、0.4mol～0.7molco(nh2)2、0.25mol～0.5molcacl2.2h2o、0.1mol～0.5molnh4cl、0.01mol～0.1molnahco3。
在本实施例中，菌株的矿化能力的验证，选取单菌落并检测其矿化能力，挑选具有矿化能力的菌株。分别将不同的单菌落放入液体培养基中培养2d～3d后，接种1～10ml菌液至营养液中，将出现白色沉淀的混合液静置24h，并由xrd等鉴定白色沉淀物质。
实施例4
本实施例公开采用实施例1的沙漠自源矿化菌株的分离方法分离的菌株，所述菌株诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法。
菌株诱导碳酸钙沉淀固结砂土的方法包括步骤：选择粒径0.074mm～2mm的砂土，将砂土和菌液混合搅拌均匀制备成砂土试样，并使整个砂土试样浸入营养液中，为菌液中菌株的生长提供所需的营养，使菌株在新陈代谢过程中充分发挥其矿化能力，不断诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒孔隙中，使砂土得到固结。
在本实施例中，选择砂土粒径0.074mm～2mm，将砂土和菌液混合搅拌均匀制备成砂土试样，并使整个试件浸入营养液(包括3％～6％nutrientbroth、0.4mol～0.7molco(nh2)2、0.25mol～0.5molcacl2.2h2o、0.1mol～0.5molnh4cl、0.01mol～0.1molnahco3等)，为菌体的生长提供所需的营养，使gy1#在新陈代谢过程中充分发挥其矿化能力，不断诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒孔隙中，使砂土得到固结，强度得到提高，且当菌液浓度od600为0.6～2.5时，砂土试件强度范围为0.9～4.3mpa。
实施例5
将粒径0.074mm～2mm的砂土150g～160g与40ml菌液掺拌均匀，并制备成尺寸为50×50mm的试件，并使试件完全浸入固化营养液中，通入氧气，使微生物与营养液充分反应5～10天，即可得到固化后的砂土试件，见图3。
无侧限抗压强度实验中，当od600为2.5时，强度达到了4.3mpa。通过固化后的试件进行x射线衍射分析，扫描角度为20°～80°，扫描方式为广角测角仪，单独扫描，白色物质主要为caco3晶体，晶体型为a型方解石，见图4。通过sem电镜扫描图像可以清晰的看到，砂粒的表面及周围都出现了caco3结晶，颗粒与颗粒之间由caco3粘结，整个试样变的致密，且出现晶体重叠现象，见图5。由能谱分析结果可以看到，生成的物质中有c、o、si、cl、ca元素，且钙元素占40.25％，见图6。
通过本发明的方法，一种新型葡萄球菌gy1#固化后的砂土试样强度和均匀性效果较好，土颗粒间连接致密，粘聚力增加，整体强度较高。本发明验证了从土壤中提取的新型葡萄球菌gy1#为沙漠风沙土中的自源菌株，有很好矿化能力，且不破坏原有土壤的生态环境，提高了此项发明的技术性，适合大规模推广砂类土壤的结皮与改良。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。