本发明涉及分子生物学遗传育种技术领域，特别涉及一种光敏雄性不育基因筛选方法。
背景技术
水稻是我国单产最高、播种面积最大的粮食作物，杂交水稻被称为我国“第五大发明”，水稻杂种优势利用是构建我国粮食安全生产体系的核心技术之一。“三系法”和“两系法”是当前水稻杂种优势利用的主要途径。但由于亲本利用资源和制种安全性的原因，限制了这两种途径全面开发水稻杂种优势的潜力。
水稻是世界三大粮食作物之一，全球的国家均有种植，全世界一半以上人口(包括几乎整个东亚和东南亚人口)以水稻为主粮，栽培面积约亿公顷，产量在亿吨以上。水稻是我国种植面积最大、单产最高、总产最多的粮食作物，我国水稻播种面积约占世界水稻播种面积的，居世界第二位；稻谷年平均总产量约占世界稻谷总产量的，居世界第一位。
中国也是杂交水稻的发源地和第一个将杂交水稻大面积应用于生产的国家，生产实践证明，在相同条件下，杂交水稻一般比普通良种增产左右。目前，我国杂交水稻种植面积占全国稻作面积的以上，产量占稻谷总产量的。以提高农作物单位产量为主要目的的杂种优势利用被认为是最为经济、有效的提高粮食产量的途径。
杂种优势是指杂种代在生长、生活、繁殖、适应性、抗性及产量均优于双亲的现象。杂种优势利用进行杂种生产的主要方法有：雄性不育制种，人工去雄制种，理化因素杀雄制种，标记性状制种，自交不亲和性制种和雌性系制种。雄性不育制种是利用植物雄性不育性克服人工去雄困难、利用杂种优势最经济、有效的途径。被子植物从雄荡原基分化到形成有功能的成熟花粉粒，要经历一系列的形态、生理生化各方面的变化，在这些变化中，如果任一过程受阻，雄性器官就不能正常发育，不能形成有生活力的花粉，这种现象被称为雄性不育。
雄性不育现象在自然界普遍存在，自发突变、种间甚至属间的人工杂交或天然杂交、理化诱变以及生物技术都可以产生雄性不育。分类学上一般把雄性不育性分为三种类型(见图由细胞核基因控制的核雄性不育；由细胞质基因控制的质雄性不育；由细胞核和细胞质基因共同控制的核质互作型雄性不育。质雄性不育由于其母性遗传特点，育性不能恢复，在生产上应用价值低。核质互作型雄性不育材料由于其既具有保持系，又具有恢复系，已在生产上广泛应用，即杂种优势利用的“三系”途径。
核雄性不育按基因的显隐性可以分为显性雄性核不育和隐性雄性核不育两类。水稻隐性核雄性不育材料发现较多，可将其分为四种类型，即光周期敏感型核雄性不育光敏核不育)、温度敏感型核雄性不育(温敏核不育)、光温互作型核雄性不育(光温互作核不育)和无条件型核雄性不育(普通核不育。前三者为条件型核雄性不育，是杂种优势利用的“两系”途径的基础，最后一类无条件型核雄性不育又被称为普通核不育或一般核不育，是因为这种隐性核雄性不育在水稻能正常生长的条件下均表现不育。
石明松在晚粳品种农垦群体中发现光敏核不育株后，开启了基于条件型不育类型的“两系”杂交水稻研究。袁隆平教授提出杂交水稻育种的战略设想，提出结合光温敏核不育基因和广亲和基因，利用亚种间杂种优势，培育亚种间杂交水稻，提升杂种优势的利用水平。“两系”杂交水稻由于不受恢保关系的制约，配组自由，亲本的遗传多样性得到明显改善，杂种优势利用水平提升，选育出高产杂交稻组合的速度明显加快，两系杂交稻单产比现有三系杂交稻增产促进了超级杂交稻的研究和生产。中国农业部资料显示，至年全国两系杂交稻种植面积已有万，占杂交水稻种植面积的。
两系杂交稻的制种产量低、制种存在风险是目前影响两系杂交稻大面积推广的最大问题。由于光温敏不育系一系两用，育性受外界环境影响，制种阶段的育性敏感期光温条件的异常变化，可使光温敏核不育性出现波动而恢复可育，自交结实，影响自交种子纯度，导致制种失败。由于天气变化一般是全国性的，两系法制种失败也可能是全国性的，特别是近年来，极端天气频发，严重威胁我国的种业安全。育种家通常通过降低光温敏核不育系的不育起点温度来控制两系制种的安全。不育起点温度低，且在低于临界温度时还需要较长的感受时间才能恢复的可育系，才是具有实用价值的光温敏核不育系。
ssr分子标记技术因其操作简单、重现性好等优点已应用于不同植物遗传关系、遗传多样性及基因初步定位等方面的研究。在雄性不育基因的定位方面，曹双河等通过对光光敏雄性不育品系农大3338进行ssr标记，通过对亲本间的多肽性进行标记，获得了40％的多态性。在近等基因池中筛选出了4个多态性ssr标记，在定位群体的部分个体中分析，发现其中的3个ssr标记(ubc818、ubc830、ubc880)与光敏雄性不育有明显的连锁关系，均为显性可利用标记。
丁明忠等(2008)采用ssr标记技术，用100条ssr引物对8个苎麻品种间的遗传关系进行标记分析，获得了1个与雄性不育连锁的分子标记u835，对筛选到的扩增产物进行克隆和测序，得到片段大小为658bp的序列。段继强等(2008)也采用ssr分子标记技术，用38个ssr引物对苎麻细胞质雄性不育“三系”(不育系、保持系和恢复系)进行多态性分析。
普通核不育具有来源广泛、无恢保关系限制、败育彻底且育性不受环境影响、单隐性基因控制易于转育等特点，是理想的杂种优势利用资源，但由于其繁殖问题而不能应用于生产。水稻工程核不育体系的创制研究，拟通过基因工程手段解决普通核不育的繁殖问题，建设“第三代杂交水稻”应用体系。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种水稻光敏雄性不育相关基因分子标记方法，为了提高水稻光敏雄性不育种质的选择效率，运用dna分子标记ssr技术找到与水稻光敏雄性不育基因连锁的分子标记，加快光敏雄性不育系选育及利用进程。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种光敏雄性不育相关基因筛选方法，包括以下步骤：
g1.选取水稻不育系籼型hs-1与日本晴杂交组合的f2高可育和高不育单株各12～18株，苗期分别取单株的新鲜叶片，采用ctab方法提取基因组dna不育和可育基因池构建采用bsa法；
g2.ssr标记采用水稻ssr随机引物；
g3.pcr扩增；
g4.获得的特异片段克隆；
g5.利用筛选到的水稻光敏雄性育基因的ssr标记，对水稻材料进行ssr标记筛选。
所述步骤g2，进一步包括：采用水稻ssr随机引物，选择28条ssr随机引物对不育和可育基因池进行标记。
所述ssr-pcr反应体系，进一步包括：25μl反应体积，内含10×pcr反应缓冲液2.5μ1、0.5utaqdna聚合酶、0.2mmol/ldntps、0.5μmol/l引物、62ng模板dna。
所述ssr-pcr反应体系中，退火温度为46.3℃。
所述ssr-pcr扩增程序包括：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，45.8℃退火45s，65℃延伸1.5min，36个循环；最后65℃延伸7min，4℃保存。
所述步骤g4，进一步包括：采用a-t克隆法，经蓝白斑筛选，电泳检测，将阳性克隆提交测序公司测序。
所述步骤g5，进一步包括：利用筛选到的水稻光敏雄性育基因的ssr标记，对水稻材料进行ssr标记筛选，并对筛选到的材料进行大田鉴定，从中进行获得育性稳定、综合性状优良的水稻光敏雄性不育系。
所述筛选到的片断总共有该片断共有519个碱基，各个碱基数为：a：187个；c：131个；g：82个；t：119个。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种利用如前述任一项所述光敏雄性不育相关基因筛选方法，筛选到的ssr分子标记对水稻材料进行分子标记的方法。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述任一项方法在光敏雄性不育相关基因筛选中的应用。
本发明有益效果包括：本发明水稻光敏雄性不育相关基因分子标记方法，将常规水稻育种技术与分子标记辅助育种技术有机结合，创新具有育性稳定和综合性状优良光敏雄性不育水稻新种质资源，为解析水稻光敏雄性不育的分子机理更好的利用水稻光敏雄性不育奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例所述水稻光敏不育基因ssr分析；
图2为本发明实施例所述水稻光敏不育f2代基因ssr分析；
图3为本发明实施例所述特异片段的回收鉴定。
具体实施方式
下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。
在本发明一实施例中，提供了一种水稻光敏雄性不育相关基因分子标记方法。
1材料和方法
1.1材料本试验以水稻光敏雄性不育系籼型hs-1和可育系日本晴为试验材料。选取光敏水稻不育系籼型hs-1与日本晴杂交组合的f2后代。
1.2方法
不育和可育材料的基因组dna提取：
(1)选取水稻不育系籼型hs-1与日本晴杂交组合的f2高可育和高不育单株各12-20株，苗期分别取单株的新鲜叶片，采用ctab方法提取基因组dna不育和可育基因池构建采用bsa法。
(2)ssr标记采用水稻ssr随机引物，选择28条ssr随机引物(编号和序列见下表1)对不育和可育基因池进行标记。
(3)pcr扩增反应体系及条件
ssr-pcr反应体系：25μl反应体积，内含10×pcr反应缓冲液(含mg2+)2.5μl、0.5utaqdna聚合酶、0.2mmol/ldntps、0.5μmol/l引物、62ng模板dna。退火温度为46.3℃。
扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，45.8℃退火45s，65℃延伸1.5min，36个循环；最后65℃延伸7min，4℃保存。
(4)获得的特异片段克隆，采用a-t克隆法，经蓝白斑筛选，电泳检测，将阳性克隆提交测序公司测序。
(5)分子标记的应用
利用筛选到的水稻光敏雄性育基因的ssr标记，对28份水稻材料进行ssr标记快速筛选，并对筛选到的材料进行大田鉴定，从中进行获得育性稳定、综合性状优良的水稻光敏雄性不育系。
表1ssr引物编号和序列：
xm01cacacacacacacacat
xm02accaccaccatcaccacc
xm03cacacacccacacacaa
xm04agcagcagccgcagcagc
xm05cacacacacacacacag
xm06agtagtagtagtagtagt
xm07gtgtgtgtgtgtgtgta
xm08atgattatgatgatgatg
xm09gtgtgtctgtgtctgtc
xm10ccgccgccgccgccgccg
xm11gtgtgtgtgtgtgtgtt
xm12ctcctccttctcctcctc
xm13tctctctctctctctca
xm14ggcggcggcggcggcggc
xm15tctctctctctctctcc
xm16gaagaagaagaagaagaa
xm17ctctctgtctctctctt
xm18gttgttgttgttgttgtt
xm19acacacacacacacact
xm20tgctgctgctgctgctgc
xm21acacacacacacacacc
xm22tattattattattattat
xm23acacacacacacacacg
xm24gatagatagatagata
xm25tgtgtgtgtgtgtgtga
xm26gacagagagacagaca
xm27tgtgtgtgtgtgtgtgc
xm28cccttcctccctccct
注：r＝(a，g)；y＝(c，t)，b＝(c，g，t)(i.e.nota)；d＝(a，g，t)(i.e.notc)，h＝(a，c，t)(i.e.notg)；v＝(a，c，g)(i.e.nott)。
结果分析
f2分离群体的ssr分析在供试的28条引物中，27条引物在水稻光敏不育群体与可育群体间没有多态性，只有1条引物(编号：xm22)引物在水稻光敏不育群体和可育群体间具有多态性(见图1)，多次重复试验表明，用xm22作引物扩增到的多态性具有良好的重复性，都在光敏不育混合群体中扩增产物中都出现了一条分子量约为500bp的片段，而可育系混合群体没有这条谱带。
f2分离群体中单株及籼型hs-1的ssr分析
用引物对籼型hs-1、日本晴及f2不育和可育单株进行ssr分析。结果表明，引物xm22在光敏雄性不育系籼型hs-1及f2代不育单株中都能扩增出约500bp这一特征带，如图2所示，而在日本晴及f2代可育单株中则没有这一特征带，且重复性也很好，可以作为光敏不育基因的连锁标记。因此，按扩增引物统一命名的规定：将引物xm22扩增出的多态性产物定名为xm22-500，作为水稻光敏型雄性不育基因的连锁标记。
xm22-500的克隆及测序特异片段xm22-500采用凝胶回收试剂盒进行回收，回收后经过电泳检测，发现片段为500bp左右大小的条带，证明回收成功(见图3)。然后将回收的dna片段重组进pgm-t载体中，转化大肠杆菌，用试剂盒进行鉴定，发现其中一条带与ssr扩增所获得的特异片断电泳距离相近，表明特异片段克隆成功。经测序公司测序，特异片段xm22-500的序列如下：该片断总共有519个碱基，各个碱基数为：a：187个；c：131个；g：82个；t：119个；a：36.0％；c：25.2％；g：15.8％；t：22.9％；a+t＝59.0％，g+c＝41.0％。
利用筛选到的ssr分子标记xm22-500对35份材料进行筛选，结果发现，在第17、21、28、33四份材料中扩增出与水稻光敏核雄性不育紧密连锁的目的条带，并对这4份材料进行大田的栽培试验验证，不育温度范围内的不育度达100％，可育温度范围内育性完全恢复。
本发明尝试利用ssr方法对水稻光敏雄性不育进行分子标记，运用28条ssr引物对其进行标记分析，筛选到1条与水稻光敏雄性不育相关的引物xm22-500其余引物扩增的条带均不同程度出现均一化现象，多态性不够明显，对xm22-500进行克隆测序，获得了519bp的片段。因此，本发明为建立水稻分子标记辅助选择系统为有效利用不育资源，加快杂交品种选育的选育进程创造了条件。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。