一种巨大芽孢杆菌BM22及其微胶囊制剂和应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌，尤其涉及的是一种巨大芽孢杆菌BM22菌株及其微胶囊制剂和在花椒流胶病中的应用。

背景技术：

花椒为芸香科、花椒属落叶灌木或小乔木，是世界范围内花椒属植物的主要经济栽培种，在我国栽培和使用历史悠久，品种资源繁多，且栽培范围广泛。花椒生物活性成分繁多，具有较高的药用、食用和生态价值。其果实呈圆形，绿豆大小，其外皮是一种常用香料，并可提取芳香油，又可入药，种子可食用，也可加工制作肥皂，同时花椒也是干旱半干旱山区重要的水土保持树种。在药用价值中，其在消化系统、心血管系统、抑微生物作用、抗癌作用等研究以及化工、农药等领域的开发应用广泛，有温中行气、逐寒、止痛、杀虫等功效；可治胃腹冷痛、呕吐、泄泻、血吸虫、蛔虫等症，又作为表皮麻醉剂。

花椒流胶病是由真菌引起，具有很强的传染性，一年生嫩枝染病后当年形成瘤状突起，次年5月病斑扩大，病体开裂溢出树脂，初为无色半透明软胶，后变为茶褐色结晶状；多年生枝染病，产生水泡状隆起并有树胶流出。随着病菌侵害，受害部位坏死，导致枝干枯死。目前关于花椒流胶病有病原、发生与危害、化学防治等方面的报道，但对环境友好、人畜安全、可持续利用的生物防治并未涉及，有关花椒流胶病生物防治及其制剂研究仍为空白。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治花椒流胶病中的缺陷，提供了巨大芽孢杆菌BM22菌株、微胶囊制剂及其制作方法和在花椒流胶病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22菌株于2017年6月15日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲叶片，该菌对花椒流胶病菌抑菌率达到98％以上，已经于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15070。

本发明巨大芽孢杆菌BM22在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

本发明巨大芽孢杆菌BM22的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明巨大芽孢杆菌BM22的微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)巨大芽孢杆菌发酵液：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下将营养肉质培养液盛于三角瓶中，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌发酵液；

2)微胶囊制剂：将载体、助剂和保护剂按比例在通氧控制下，装入广角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌发酵液，接种量为总量的10％，混合均匀，以玉米淀粉为微胶囊制剂壁材，将混合物与玉米淀粉混合后在气流喷雾干燥机中干燥(进风温度为155℃，进样流量为550mL/h，喷雾压力为0.20MPa)，得到巨大芽孢杆菌微胶囊制剂。

进一步的，所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

进一步的，所述的助剂包括载体、分散剂、润湿剂和稳定剂，所述的载体、分散剂、润湿剂、稳定剂和保护剂按重量百分含量具体为：分散剂8％，润湿剂5％，稳定剂6％，保护剂4％，载体补足100％。

进一步的，所述的载体为白炭黑，所述的分散剂为木质素磺酸钙，所述的润湿剂为聚乙二醇，所述的稳定剂为草酸，所述的保护剂为核黄素。

通过上述制备方法得到的微胶囊制剂的性能指标为：米黄色粉末，球状粒径在3-10μm左右，含水率为3.22％，ph6.98，325目细度通过率为99％。

上述制备方法制备得到的巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂也在本发明的保护范围之内。

所述的巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂中活芽孢的含量不低于1×10⁹cfu/g。

本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22在防治花椒流胶病中的应用，当然本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或次级代谢产物在防治花椒流胶病中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的微胶囊制剂在防治花椒流胶病中的应用，未发病花椒在春季用制剂稀释液涂抹枝干一次，发病花椒在春、秋季刮除流胶后用制剂稀释液涂抹病斑各一次。

本发明的有益效果为：

本发明提供的巨大芽孢杆菌BM22及其微胶囊制剂储藏时间长，存活率高，对花椒流胶病有良好防效，抗逆性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，无公害、绿色环保，可持续控制病害发生，生产成本低。

附图说明

图1是本发明巨大芽孢杆菌BM22rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是基于16S rDNA序列构建的菌株BM22的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1巨大芽孢杆菌BM22的分离与鉴定

1.1巨大芽孢杆菌BM22的分离

在四川大邑仰天窝药场杜仲黑斑病发生区取健康杜仲叶片。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的叶片剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm花椒流胶病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度，效果优良的菌株(表1)为BM22，抑菌圈直径达到21.2mm。

表1内生细菌对花椒流胶病菌(Phytophthora citrophthora)的抑制作用

1.2菌株的鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌BM22为巨大芽孢杆菌。

表2菌株BM22生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的BM22菌株的单菌落乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定BM22菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为949bp的DNA片段(图1)，将BM22菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，BM22菌株与JX286698以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明BM22与Bacillus megaterium的亲缘关系最近。

基于以上特征，所述菌种其分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22，已于2017年12月15日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

实施例2巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂的制作

根据实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM22，经过发酵、干燥制成微胶囊制剂，具体包括以下步骤：

1)发酵液：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度28-30℃，初始pH值6.5，120r/min振荡培养36h，制成巨大芽孢杆菌BM22发酵液。其中营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

2)微胶囊制剂：将木质素磺酸钙8％，聚乙二醇5％，草酸6％，在通氧控制下，装入300mL广角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22发酵液，接种量为总质量的10％，混合均匀；以玉米淀粉为微胶囊制剂壁材，将上述混合物与玉米淀粉混合，白炭黑补足100％，后在气流喷雾干燥机中干燥(进风温度为155℃，进样流量为550mL/h，喷雾压力为0.20MPa)，制成巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂，然后保存。

微胶囊制剂指标：1×10⁹cfu/g活芽孢，米黄色粉末，球状粒径在3-10μm左右，含水率为3.22％，ph6.98，325目细度通过率为99％。

制剂保存：袋装干燥常温保存1.5年或低温(4度)3年不影响防治效果。

实施例3巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂对花椒流胶病的预防实验

1)BM22微胶囊制剂稀释液准备：将上述制得的1g微胶囊制剂分别用50、100、200、400、800、1600、2400mL稀释，制成稀释液。

2)未发病花椒林地，在每年春季用1)中制剂稀释液涂抹枝干1次，1-2年生50mL，3-5年生80mL，5年生以上100-150mL，以清水为对照。

3)涂抹后30d，按照表3中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果，结果如表4所示。

表3花椒流胶病病害分级标准

发病率(％)＝(病株数/株数总和)×100；

病情指数＝[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表值]×100；

防治效果(％)＝[(对照病情指数增长率-处理病情指数增长率)/对照病情指数增长率]×100。

表4未发病花椒林地施用后的预防效果

涂抹预防30d后，BM22微胶囊制剂稀释液对花椒流胶病表现出良好的保护效果，防治效果随稀释倍数的增加稍有降低。从表4可以看出，BM22微胶囊制剂稀释成50-400倍液的防治效果都很高，达到了100％，说明完全控制病菌的定殖、生长、繁殖，病害不发生。稀释到2400倍防效仍超过60％。因此，从经济成本考虑，将BM22微胶囊制剂应用在预防花椒流胶病发生上，在春季涂抹施用800-1600倍液一次即可达到预防效果。

实施例4巨大芽孢杆菌BM22微胶囊制剂对花椒流胶病的治疗实验

1)BM22微胶囊制剂稀释液准备：将上述制得的1g微胶囊制剂分别用50、100、200、400、800、1600、2400mL稀释，制成稀释液。

2)发病花椒林地，在每年春、秋季用1)中制剂稀释液分别涂抹枝干1次，1-2年生50mL，3-5年生80mL，5年生以上100-150mL，以清水为对照。

3)涂抹后30d，按照表3中病害分级标准进行病害调查统计，并按上述方法计算发病率，病情指数和防治效果，结果如表5所示。

表5发病花椒林地施用后的治疗效果

涂抹治疗30d后，BM22微胶囊制剂稀释液(50-800倍)对花椒流胶病表现出良好的治疗效果，防治效果随稀释倍数的增加而降低。从表5可以看出，BM22微胶囊制剂稀释成5倍液的防治效果很高，超过了90％，说明病害发生以后施用BM22能有效控制病原的进一步扩展蔓延甚至杀灭病原。800倍液防效超过50％，但是稀释到1600-2400倍液，防治效果显著下降且低于30.1％，因此，从经济成本考虑，将BM22微胶囊制剂应用在治疗花椒流胶病上，在春、秋季涂抹施用400-800倍液各一次即可达到治疗效果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种巨大芽孢杆菌BM22及其微胶囊制剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 1

caggctgcgg ggctatacat gcagtcgagc gaactgatta gaagcttgct tctatgacgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacttcgg 120

gaaaccgaag ctaataccgg ataggatctt ctccttcatg ggagatgatt gaaagatggt 180

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accaaggcaa cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

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actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 540

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