本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法
背景技术
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒,是一种dna病毒，根据目前所知，hbv只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，也会被称为丹娜颗粒(dane)。1965年由丹娜发现，直径为42纳米，颗粒分为外壳和核心两部分。乙型肝炎病毒(hbv)基因组长约3.2kb，为部分双链环状dna。中国的乙肝病毒感染率约60％-70％，乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18％，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。
目前hbvdna定量的金标准是罗氏公司的cobashbv试剂盒，是一种基于taqman技术的定量pcr方法。这种方法hbv-dna检测治疗前进行病毒定量检测，可以选择针对性的药品，避免盲目用药，同时也可直接准确地测定体内病毒数量，有助于判断治疗乙肝的效果。
虽然hbvdna的荧光定量检测方法，已经是一种相对成熟的临床检测方法，但是该方法具有一些缺点，如操作步骤较多，不仅耗时较长，而且易污染，同时会产生较多的废弃物，不利于环境的保护。另外，提取试剂引入的抑制剂，以及洗涤步骤中hbvdna的损失，都会降低试剂的检出性能。
申请人多年一直致力于hbv检测试剂盒的研究，已有hbv检测类的发明专利201410223058.2，其公开了检测乙型肝炎病毒的pcr引物、引物组、探针以及试剂盒和检测方法，该发明可检测出世界范围内各种不同亚型的乙型肝炎病原体，在血清标本中定量检测限可达2iu/ml。但该发明采用的dna裂解液为常规裂解液，操作相对不够简单，耗时相对较长。
市面上也有如湖南圣湘生物的一步法的hbv荧光定量方法,如中国专利200910309980.2公开了一种一步法病原体核酸荧光定量pcr检测方法，针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的pcr反应液，实现pcr荧光定量检测，该发明操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，所用试剂制造成本低，但无法对血清中低至20iu/ml的hbvdna进行准确定量。
多果定(十二烷基胍醋酸盐，dodine)，是一种含胍基的特殊表面活性剂。主要作为日化用品类表面活性剂，防治果树、蔬菜病害，主要为作用保护，而非无内吸。多果定的防治果树、蔬菜、坚果、观赏植物和成荫树上的多种主要霉菌病害。此外，用于工业水处理剂，洗涤剂，种子处理剂和妇女儿童用品等。
本发明公开了一种实时荧光定量pcr方法，通过使用多果定代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)和一部分去污剂(常用的有tween-20、tritonx-100、sds等)的使用，有效地对含有hbv病毒颗粒的血清样本进行裂解，释放其中的hbvdna，并降低对下游实验的抑制，从而显著的提高了hbv病毒的裂解效率，并大大缩短了检测时间。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法。
首先，本发明提供一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒，
该试剂盒包括：
乙型肝炎病毒hbv的检测引物组；
乙型肝炎病毒hbv的检测探针；
和裂解液；
所述的裂解液包括0.1％-30％(v/v)的多果定、5-10％(v/v)tween-20、10-50mm柠檬酸钠和10-100mmnacl；
优选的，所述裂解液包括2％-28％(v/v)的多果定、5-8％(v/v)tween-20、10-20mm柠檬酸钠、30-100mmnacl；
更优选的，所述裂解液包括5％-28％(v/v)的多果定、6-8％(v/v)tween-20、12-20mm柠檬酸钠、40-100mmnacl。
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测引物组为引物组a或引物组b；
所述的引物组a由以下引物序列组成：
引物序列1：ggcaacggcctggtctgtgccaagtgt，
引物序列2：ggcaacggtcaggtctctgccaagtgt，
引物序列3：tgacgcaacccccactg，
引物序列4：gctgcgagcaaaacaag，
引物序列5：gcgcaggatccagttggcagcaca，
引物序列6：gtcccgcgcaggatccagttggcagc；
所述的引物组b由以下引物序列组成：
引物序列7：gccgacagtatctgaacctttaccccgttg，
引物序列8：gcaacggtcaggtctgtgccaagtgttt，
引物序列9：gctgacgcaacccccac，
引物序列10：cggctgcgagcaaaaca，
引物序列11：ccgcgcaggatccagttggcagcaca，
引物序列12：cccgcgcaggatccagttggcagcac；
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测探针为以下四条探针序列中的任意一条：
探针序列1：ccgatccatactgcggaact，
探针序列2：ccgatccatactgcggaac，
探针序列3：gccgatccatactgcggaact，
探针序列4：gccgatccatactgcggaac；
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测探针序列5’端标记的荧光基团为fam、hex、vic、cy5、tet中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为tamra、mgb、bhq中一种。
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括内控探针和内控引物组；
所述的内控探针的核苷酸序列为：
内控探针序列5：atgccctcccccatgccatcct；或者为其核苷酸互补序列；
内控探针序列所标记的荧光基团可从fam、hex、vic、cy5、tet选择，但不同于权利要求3所述探针的荧光基团；
所述的内控引物组的核苷酸序列为：
内控引物序列13：cggggtcacccacactgtgcccatctacg，
内控引物序列14：ggtcacccacactgtgcccatctacg，
内控引物序列15：ccacactgtgcccatctacga，
内控引物序列16：gcgctcggtgaggatcttc；
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括pcr反应液，所述的pcr反应液包括：15-25mmtris-hclph8.0，15-25mmkcl，2.5-5mm(nh4)so4，2-5mmmgcl2，0.5-2mmdntp/utpmix。
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括强阳性对照品、临界阳性对照品、阴性对照品和阳性定量参考品中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法；
所述实时荧光定量检测方法包括以下步骤：
(1)、血清hbvdna样本的获取：
a.将血清送检管震荡10-15秒，彻底混匀后立即取200μl至1.5ml灭菌离心管中，随后加入20μl磁珠、20μlcarrierrna、300μl裂解液，颠倒混匀，50-55℃振荡温育5-10分钟；
b.把离心管转移至磁力架上放置5-10分钟收集磁珠，吸弃上清液；
c.短暂离心收集管壁的液滴，把离心管转移至磁力架上放置1分钟，小心吸弃所有的残液，打开管盖干燥5-10分钟；
d.加入50μl洗脱液涡旋混匀20秒，静置3分钟，转移离心管至磁力架上放置3分钟收集磁珠；
e.把样品转移至新的离心管中，并保存于-20℃，作为实时荧光定量pcr反应的dna模板；
(2)、结果检测：采用实时荧光定量pcr进行检测，对结果进行分析，所述实时荧光定量pcr程序为：
第一步：37℃,5分钟；第二步：95℃,10分钟；第三步:95℃,15秒，62-68℃,15秒，72℃,20秒，5-15个循环；第四步：95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环；60℃时采集荧光；
所述的实时荧光定量pcr反应体系为：
pcr反应液，43.2μl；5u/μltaq酶，0.8μl；1u/μlung酶，0.06μl；步骤(1)得到的dna模板，6μl；
其中，步骤(1)a中所述的裂解液包括0.1％-30％(v/v)的多果定、5-10％(v/v)tween-20、10-50mm柠檬酸钠、10-100mmnacl；
优选的，所述裂解液包括2％-28％(v/v)的多果定、5-8％(v/v)tween-20、10-20mm柠檬酸钠、30-100mmnacl；
更优选的，所述裂解液包括5％-28％(v/v)的多果定、6-8％(v/v)tween-20、12-20mm柠檬酸钠、40-100mmnacl。
其中，步骤(2)中所述的pcr反应液包括：15-25mmtris-hclph8.0，15-25mmkcl，2.5-5mm(nh4)so4，2-5mmmgcl2，0.5-2mmdntp/utpmix，200-600nm引物组，100-300nm探针，200-600nm内控引物，100-300nm内控探针。
本发明裂解液中的多果定通常被作为日化用品类表面活性剂，还能防治果树和蔬菜病害，此外多果定还用于工业水处理剂，洗涤剂和种子处理剂。目前还没有人将普遍用于日化用品的多果定用于生物学领域hbv病毒的裂解，本发明通过用多果定代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)和一部分去污剂(常用的有tween-20、tritonx-100、sds等)的使用，有效地对含有hbv病毒颗粒的血清样本进行裂解，释放其中的hbvdna，显著的提高了hbv病毒的裂解效率，并且大大提高了试剂盒的检测准确性。
本发明的有益效果：
本发明提供一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒及其检测方法，通过使用本发明试剂盒中独创的裂解液，避免传统hbvdna检测试剂中抑制剂残留对后续pcr的抑制。
本发明意外的发现，含有胍基的多果定，在实现对血清中hbv颗粒裂解的同时，对下游实验的抑制并不明显，因此可用多果定建立一种既能对低载量hbv病毒dna进行精准定量，又能减少操作步骤的检测方法。
本发明不需要像传统的荧光定量pcr一样进行2-3次洗涤，因此大大缩短了扩增所需时间，并有效减少了可能发生污染的环节，还减少了医疗废弃物的产生，同时显著提高了检测的准确性，因其他发明普遍需要进行洗涤，所以准确性相比本发明差很多。
本发明减少了洗涤步骤中hbvdna的损失，定量限可达20iu/ml，检出限可达5iu/ml，达到hbv超敏检测的性能水平。
本发明试剂盒中裂解液独创性的采用一定浓度的多果定代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)和一部分去污剂(常用的有tween-20、tritonx-100、sds等)的使用，有效地对含有hbv病毒颗粒的血清样本进行裂解，释放其中的hbvdna，显著的提高了hbv病毒的裂解效率，并且大大提高了本发明的试剂盒检测的准确性。
本发明采用的多果定浓度能达到最好的裂解效果，多果定浓度高时虽然会增强裂解性能，但是也会增强抑制性，所以最佳的多果定的浓度，是确定一个提取核酸浓度和纯度的平衡点，因此，并不是浓度越高裂解效果越好，即多果定的浓度和裂解效果并不成正比，也没有规律可循。
基于上述优点，本方法在hbvdna检测领域，以及其他血清中病原体dna的检测领域，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为应用本发明的免洗涤磁珠法扩增血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法检测hbvdna滴度为20iu/ml的血清标准品的效果。
图2为应用本发明的免洗涤磁珠法扩增血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法检测hbvdna滴度为5iu/ml的血清标准品的效果。
图3为应用本发明的免洗涤磁珠法扩增血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法检测hbvdna滴度为200000、20000、2000、200、20iu/ml的梯度稀释血清标准品的效果。
图4为应用本发明的免洗涤磁珠法扩增血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法检测hcvrna、hivrna、tbdna的特异性实验的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒a
该试剂盒包括：
乙型肝炎病毒hbv的检测引物组；
乙型肝炎病毒hbv的检测探针；
和裂解液；
所述的裂解液包括5％(v/v)的多果定、6％(v/v)tween-20、20mm柠檬酸钠和20mmnacl；
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测引物组由以下引物序列组成：
引物序列1：ggcaacggcctggtctgtgccaagtgt，
引物序列2：ggcaacggtcaggtctctgccaagtgt，
引物序列3：tgacgcaacccccactg，
引物序列4：gctgcgagcaaaacaag，
引物序列5：gcgcaggatccagttggcagcaca，
引物序列6：gtcccgcgcaggatccagttggcagc；
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测探针序列为：ccgatccatactgcggaact；
所述的乙型肝炎病毒hbv的检测探针序列5’端标记的荧光基团为fam，探针序列3’端标记的淬灭基团为tamra。
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括内控探针和内控引物组；
所述的内控探针的核苷酸序列为：atgccctcccccatgccatcct；
内控探针序列所标记的荧光基团为hex；
所述的内控引物组的核苷酸序列为：
内控引物序列7：cggggtcacccacactgtgcccatctacg，
内控引物序列8：ggtcacccacactgtgcccatctacg，
内控引物序列9：ccacactgtgcccatctacga，
内控引物序列10：gcgctcggtgaggatcttc；
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括pcr反应液，所述的pcr反应液包括：15-25mmtris-hclph8.0，15-25mmkcl，2.5-5mm(nh4)so4，2-5mmmgcl2，0.5-2mmdntp/utpmix。
所述的实时荧光定量检测试剂盒还包括强阳性对照品、临界阳性对照品、阴性对照品和阳性定量参考品。
实施例2一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒b
与实施例1中的实时荧光定量检测试剂盒a相比，该实施例中的实时荧光定量检测试剂盒b唯一的区别在于，裂解液中采用25％(v/v)的多果定。
实施例3一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测方法
该实施例采用实施例1中的实时荧光定量检测试剂盒a对血清中hbvdna进行实时荧光定量检测；
所述实时荧光定量检测方法包括以下步骤：
(1)、血清hbvdna样本的获取：
a.将血清送检管震荡10秒，彻底混匀后立即取200μl至1.5ml灭菌离心管中，随后加入20μl磁珠、20μlcarrierrna、300μl裂解液，颠倒混匀，50℃振荡温育6分钟；
b.把离心管转移至磁力架上放置6分钟收集磁珠，吸弃上清液；
c.短暂离心收集管壁的液滴，把离心管转移至磁力架上放置1分钟，小心吸弃所有的残液，打开管盖干燥6分钟；
d.加入50μl洗脱液涡旋混匀20秒，静置3分钟，转移离心管至磁力架上放置3分钟收集磁珠；
e.把样品转移至新的离心管中，并保存于-20℃，作为实时荧光定量pcr反应的dna模板；
(2)、结果检测：采用实时荧光定量pcr进行检测，对结果进行分析，所述实时荧光定量pcr程序为：
第一步：37℃，5分钟；第二步：95℃，10分钟；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，5个循环；第四步：95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环；60℃时采集荧光。
所述的实时荧光定量pcr反应体系为：
pcr反应液，43.2μl；5u/μltaq酶，0.8μl；1u/μlung酶，0.06μl；步骤(1)得到的dna模板，6μl；
其中，步骤(1)a中所述的裂解液包括5％(v/v)的多果定、6％(v/v)tween-20、20mm柠檬酸钠和20mmnacl；
其中，步骤(2)中所述的pcr反应液包括：15-25mmtris-hclph8.0，15-25mmkcl，2.5-5mm(nh4)so4，2-5mmmgcl2，0.5-2mmdntp/utpmix，200-600nm引物组，100-300nm探针，200-600nm内控引物，100-300nm内控探针。
对比例1一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒c
与实施例1中的实时荧光定量检测试剂盒a相比，该实施例中的实时荧光定量检测试剂盒c唯一的区别在于，裂解液中采用0.05％(v/v)的多果定。
对比例2一种血清中hbvdna的实时荧光定量检测试剂盒d
与实施例1中的实时荧光定量检测试剂盒a相比，该实施例中的实时荧光定量检测试剂盒d唯一的区别在于，裂解液中采用32％(v/v)的多果定。
实验例1关于试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c和试剂盒d对hbvdna滴度检测的准确性测试：
实施例1中的试剂盒a、实施例2中的试剂盒b、对比例1中的试剂盒c和对比例2中的试剂盒d均采用实施例3中的检测方法分别对hbvdna滴度为20、30和50iu/ml的血清标准品进行检测，检测结果如表1所示。
表1
可见，当多果定浓度分别为5％和25％时，分别对应的试剂盒a和试剂盒b对hbvdna滴度为20、30和50iu/ml的血清标准品检测结果的准确性均明显高于当多果定浓度分别为0.05％和32％的试剂盒c和试剂盒d的检测准确性。
实验例2
用实施例1中的试剂盒a和实施例3的检测方法对hbvdna滴度为20iu/ml的血清标准品进行检测，检测效果如图1所示。
实验例3
用实施例1中的试剂盒a和实施例3的检测方法对hbvdna滴度为5iu/ml的血清标准品进行检测，检测效果如图2所示。
实验例4
用实施例1中的试剂盒a和实施例3的检测方法分别对hbvdna滴度为200000、20000、2000、200、20iu/ml的梯度稀释血清标准品进行检测，检测效果如图3所示。
实验例5
用实施例1中的试剂盒a和实施例3的检测方法分别检测hcvrna、hivrna、tbdna的特异性实验的结果，结果如图4所示。
由实验例2-5可知，本发明减少了洗涤步骤中hbvdna的损失，定量限可达20iu/ml，检出限可达5iu/ml，达到hbv超敏检测的性能水平，还具有很好的特异性，且当裂解液采用0.1％-30％(v/v)的多果定时，本发明具有突出的准确性。
本发明不需要像传统的荧光定量pcr一样进行2-3次洗涤，因此大大缩短了扩增所需时间，并有效减少了可能发生污染的环节，还减少了医疗废弃物的产生，同时显著提高了检测的准确性，因其他发明普遍需要进行洗涤，所以准确性相比本发明差很多。
基于上述优点，本方法在hbvdna检测领域，以及其他血清中病原体dna的检测领域，具有广泛的应用前景。