疏螺旋体鞭毛蛋白FlaB抗体的获取方式及应用的制作方法

本发明涉及生物免疫相关领域，具体涉及疏鞭毛蛋白flab抗体制备方法，更具体涉利用所制备的抗体通过不同免疫学方法检测疏螺旋体的应用。

技术背景

回归热是由虱子和蜱作为媒介，疏螺旋体细菌感染引起的一种传染病(schwan,t.g.andj.piesman,vectorinteractionsandmolecularadaptationsoflymediseaseandrelapsingfeverspirochetesassociatedwithtransmissionbyticks.emerginfectdis,2002.8(2):p.115-21；cutler,s.j.,possibilitiesforrelapsingfeverreemergence.emerginfectdis,2006.12(3):p.369-74)。多数患者在感染后的5至15天出现临床反应，包括忽冷、忽热、头疼、肌肉或关节疼痛以及恶心反胃等症状(ramos,j.m.,etal.,resultsofa10-yearsurveyoflouse-bornerelapsingfeverinsouthernethiopia:adeclineinendemicity.anntropmedparasitol,2008.102(5):p.467-9；cutler,s.j.,relapsingfever--aforgottendiseaserevealed.japplmicrobiol,2010.108(4):p.1115-22.)，是由螺旋体产生的内毒素样物质引起的(snowden,j.ands.s.bhimji,relapsingfever,instatpearls.2018,statpearlspublishingstatpearlspublishingllc.:treasureisland(fl).)。重症可有黄疸(schwan,t.g.etal.),如不及时治疗，症状会反复发生,在患者自行缓解之前会经历1到4次发热(fotsofotso,a.andm.drancourt,laboratorydiagnosisoftick-borneafricanrelapsingfevers:latestdevelopments.frontpublichealth,2015.3:p.254；kutsuna,s.,etal.,thefirstcaseofimportedrelapsingfeverinjapan.amjtropmedhyg,2013.89(3):p.460-1.)。虽然回归热通常是一种轻微的疾病，但可能导致患者严重不适并会发生严重的后遗症甚至死亡(lopez,j.e.,etal.,real-timemonitoringofdiseaseprogressioninrhesusmacaquesinfectedwithborreliaturicataebytickbite.jinfectdis,2014.210(10):p.1639-48；forrester,j.d.,etal.,tickbornerelapsingfever-unitedstates,1990-2011.mmwrmorbmortalwklyrep,2015.64(3):p.58-60.)。回归热明确诊断主要基于在发热期采集的外周血涂片中检测螺旋体是否存在(kutsuna,s.,etal.)。但是在发作和晚期复发之间，螺旋体可能根本不可见(snowden,j.etal.；forrester,j.d.,etal.)。目前尚未研发出有效疫苗。

疏螺旋体属是长的、薄的、活动的、螺旋的或平波的细菌(guyard,c.,etal.,periplasmicflagellarexportapparatusprotein,flih,isinvolvedinpost-transcriptionalregulationofflab,motilityandvirulenceoftherelapsingfeverspirocheteborreliahermsii.plosone,2013.8(8):p.e72550.)。在螺旋体门内形成高度独特的单系谱系。该属的成员是莱姆病和回归热的病原体(adeolu,m.andr.s.gupta,aphylogenomicandmolecularmarkerbasedproposalforthedivisionofthegenusborreliaintotwogenera:theemendedgenusborreliacontainingonlythemembersoftherelapsingfeverborrelia,andthegenusborreliellagen.nov.containingthemembersofthelymediseaseborrelia(borreliaburgdorferisensulatocomplex).antonievanleeuwenhoek,2014.105(6):p.1049-72.)，莱姆病是目前北美洲和欧亚大陆温带地区最流行的媒介传播疾病，回归热是世界许多不同地区特有的疾病(elbir,h.,d.raoult,andm.drancourt,relapsingfeverborreliaeinafrica.amjtropmedhyg,2013.89(2):p.288-92；trape,j.f.,etal.,theepidemiologyandgeographicdistributionofrelapsingfeverborreliosisinwestandnorthafrica,withareviewoftheornithodoroserraticuscomplex(acari:ixodida).plosone,2013.8(11):p.e78473；wilting,k.r.,etal.,louse-bornerelapsingfever(borreliarecurrentis)inasylumseekersfromeritrea,thenetherlands,july2015.eurosurveill,2015.20(30).)。

但如何获得更快的制备有效的抗体用于回归热螺旋体的血清学检测是需要研究的课题。

技术实现要素：

疏螺旋体鞭毛蛋白flab具有保守性而且是主要的抗原蛋白，本发明通过原核表达系统表达疏螺旋体鞭毛蛋白flab，并用纯化的鞭毛蛋白flab免疫小鼠，制备抗flab抗体，以期为回归热螺旋体的血清学检测及后续其它研究奠定基础。

对此，本发明提供一种疏螺旋体鞭毛蛋白flab的抗体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)用鞭毛蛋白flab免疫小鼠；

(2)收集免疫后小鼠血清制备抗体，所述抗体用于检测螺旋体。

优选地，所述鞭毛蛋白flab通过基因工程获得，更优选地，所述鞭毛蛋白flab通过基因工程获得方法具体包括如下步骤：

(1)扩增疏螺旋体flab基因引物的设计；

(2)疏螺旋体flab基因的pcr扩增；

(3)疏螺旋体鞭毛蛋白flab基因克隆；

(4)疏螺旋体鞭毛蛋白flab表达和蛋白纯化。

进一步地，上述免疫小鼠的步骤为：

(1)取免疫前的小鼠全血制备免疫前血清，制备抗原溶液；

(2)抗原溶液与佐剂quickantibody–mouse5w混合制备免疫注射药剂；

(3)通过小鼠左右大腿进行肌肉注射，3周后以同样方式加强免疫一次；

(4)免疫5周后收集免疫后小鼠血清制备得到的抗体。

更优选地，所述抗原溶液与佐剂quickantibody–mouse5w的混合是按1：1的比例混合；所述小鼠是8-12周龄balb/c小鼠。

此外，所述肌肉注射中，每针次100ul，抗原免疫剂量为40ug。

优选地，收集免疫后小鼠血清制备得到的抗体具体是将血清放入37℃培养箱处理1小时后再进行4℃过夜处理，之后在室温、8000g的条件下进行离心10分钟，所取上清即为免疫血清。

本发明因而还提供上述的方法制备得到的抗体。

本发明同时还提供一种体外检测螺旋体细菌的方法：用如上述的方法制备得到的抗体，通过elisa、westernblot，或免疫荧光方法检测螺旋体。其中，所述抗体能够用于检测2种不同的螺旋体，即赫母斯氏包柔氏螺旋体(borreliahermsii),又能检测莱姆病螺旋体(borreliaborgidorferi)。

本发明建立了疏螺旋体鞭毛蛋白flab抗体制备的方案，得到效价较高的抗体，并且可以特异性地检测螺旋体，为螺旋体的检测和深入研究打下了坚实的基础，具体如下：

1.首次在大肠杆菌中表达并获得了高纯度的螺旋体flab蛋白，这是由于本发明人发现通过基因工程表达该蛋白绝大部分以包涵体的形式表达，因而可以获得高纯度的目的蛋白。该蛋白能作为抗原用于螺旋体感染的血清学检测。

2.采用佐剂quickantibody-mouse5w(需要的抗原量小、免疫时间短、能帮助产生高滴度的抗体)在短时间内(5周内)获得了非常高效价的抗体：该方法即省时间、又节省抗原，而且所获得抗体效价很高。

3.通过免疫小鼠获得了抗螺旋体flab的抗体，所获得的抗flab的抗体能检测2种不同的螺旋体，即：赫母斯氏包柔氏螺旋体(borreliahermsii),又能检测莱姆病螺旋体(borreliaborgidorferi)，且效价都在1:3200以上。

4.本发明获得的抗体能够适合于免疫印迹法、elisa法和免疫荧光法分析，其效果都比较好。

附图说明

图1.flab基因片段的扩增和克隆。根据genbank中发布的hs1分离株的flab序列(id:cp014349)以及pet30a载体克隆位点2端的序列，设计引物和退火温度梯度扩增flab基因片段(a)。载体pet30a经ndei和xhoi酶切线性化，扩增得到的flab通过in-fusioncloning的方式克隆到pet30a载体中，与6xhis标签形成融合基因(b)。

图2.flab蛋白的表达与纯化。(a)重组质粒pet30a-flab转入bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞后，通过0.5mm的iptg进行诱导表达。表达细菌经超声破碎后，分为表达上清(s)和表达沉淀(p)，经sds-page电泳分析表达情况。然后，(b)通过westernblot方法用抗体his标签的抗体进一步确认表达的融合蛋白。(c)沉淀中的蛋白用8m尿素溶解悬浮。通过ni柱进行亲和纯化，sds-page电泳分析纯化后的蛋白：ft(flow-through)表示穿过液，w(wash)表示洗涤液，e1(elution1)表示30mm咪唑洗脱液，e2(elution1)表示300mm咪唑洗脱液。

图3.elisa分析抗体效价。40ug纯化蛋白与等体积佐剂混合后，经肌肉注射8-12周龄balb/c小鼠。3周后加强免疫一次。免疫5周后，经眼球采血收集非抗凝血，分析血清(im)。用纯化的flab蛋白包被elisa板(0.5ug/孔)，血清抗体经一系列倍比稀释后，进行效价分析。空白对照用pbs代替flab蛋白，阴性对照为免疫前小鼠血清(preim)。

图4.抗flab抗体在螺旋体分析上的应用。(a)western-blot分析螺旋体。两种不同的螺旋体蛋白样品，经sds-page电泳后，转移到pvdf膜上，使用抗flab抗体(1：250)进行检测分析。(b)elisa分析螺旋体。两种不同的螺旋体经热灭活后，每孔5x10⁴个包被96孔elisa板。抗flab抗体按如图稀释后，用于检测螺旋体。(c)免疫荧光检测螺旋体。3×10⁵个螺旋体经甲醇固定在玻片上后，使用1：250倍稀释的抗flab抗体作为一抗，alexafluor-488标记的抗鼠igg抗体为二抗进行检测分析，用dapi染核酸，封片后在荧光显微镜下检测分析。

具体实施方式

一、研究材料

1.实验动物

本研究使用的雄性balb/c小鼠(8-12周龄)，来自中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心，实验动物生产许可证[scxx(滇)k2017-0002]，使用许可证[syxk(滇)2014-0002]。所有的动物使用程序都由自中国医学科学院医学生物学实验动物伦理委员会审查和批准。

2.菌株：borreliaburgdorferib31株(以下简称4680)和borreliahermsiihs1株(以下简称5251)购自ntcc。

3.实验试剂

1)抗体：anti-mouselgg抗体(cellsignalingtechnology，cat#7076p2)，alexafluor-488标记的抗鼠igg抗体(abcam，cat#ab150113)。

2)免疫佐剂：quickantibody-mouse5w(北京博奥龙免疫技术有限公司，cat#kx0210041)。

3)分子生物学相关试剂：基因组dna提取试剂盒(takara,cat#9765)；pcr扩增试剂(takara,cat#rr001a)；胶回收试剂盒(takara，cat#9762)；连接试剂盒(in-fusionhdenzymepremix，clontech,cat#st0344)；感受态细胞dh5a(taingen,cat#cb101)和bl21(taingen,cat#cb105)；质粒提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，cat#em101-02)；内切酶ndei(neb,cat#r0111v)和xhoi(neb,cat#r0146v)；

4)引物设计：根据in-fusion试剂盒连接的要求，在引物的5’分别设计15个碱基与待克隆的载体：

pet30+flabfprimer：taagaaggagatatacatatgatcataaatcataatac

pet30+flabrprimer：ggtggtggtggtgctcgagtctaagcaatgataata

二、研究过程

1.基因flab的扩增：

1)用试剂盒takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkit5.0(codeno.9765)提取细菌基因组:离心沉淀菌体(1-5x109的细菌5251于12000rpm离心2min，弃上清)；裂解细菌和消化rna(加入180ul裂解缓冲液buffergl、20ul蛋白酶k和10ulrnasea，充分混匀后于56℃水浴锅温浴10min)；沉淀核酸(加入200ulbuffergb和200ul100％乙醇，充分混匀)；将核酸吸附于滤膜上(将上述溶液移至spincolumn中，12000rpm离心2min，弃滤液)；洗柱子(将500ulbufferwa加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液)；洗柱子(将700ulbufferwb加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液)；洗柱子(将700ulbufferwb加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液)；洗脱核酸(将spincolumn安置于新的ep管上，向spincolumn膜中央加入50ul的灭菌水，室温静置5min，12000rpm离心2min)。取2ul在nanodrop上测得核酸浓度为17.9ng/ul。

2)基因flab的pcr扩增：

用1ul上述1)中的dna作为模板，通过以下方法扩增flab基因：

pcr反应体系：

pcr程序(退火温度设置为温度梯度，如下所示)：

pcr结束后，每个管里取10ul样品于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。确定pcr产物的分子量为预期大小后，将余下的pcr进行电泳纯化，并通过试剂盒回收纯化后的pcr产物，用于后期的克隆。

2.重组原核表达质粒构建：1ug质粒或pcr产物经ndei和xhoi酶切后，切除载体pet-30a的n端his-tag，保留c端的his-tag，电泳切胶纯化回收，然后通过in-fusion重组连接的方式，将flab克隆至表达载体pet-30a中，转化dh5a感受态细菌。第二天挑取克隆，进行细菌扩增培养，提取质粒送测序鉴定。具体如下：

pet-30a质粒载体酶切体系：

以上酶切混合物于37℃孵育3小时。

in-fusion克隆体系：

in-fusionhdenzymepremix2ul

载体pet-30a4ul

目的基因4ul

50℃连接15min。

转化

1)将1ul连接产物加入到100uldh5a中，冰浴30min后,于42℃干热器热击90s后，再冰浴2min；

2)向以上管中加入200ullb培养液后，放入摇床，于37℃、120rpm复苏培养30min；

3)转移适当体积的转化菌至含卡那霉素的lb平板上，用灭菌玻璃珠均匀涂布均匀后，倒置放入37℃培养箱，过夜培养；

4)第二天，挑取单克隆菌落放入2ml含卡那霉素(100ug/ml)的lb培养液中，于37℃、220rpm，过夜培养；

5)保存菌液，余下的提取质粒送去测序鉴定。

3.重组蛋白表达与纯化、鉴定：

1)0.5ul以上测序确认正确的重组质粒加入到含50ul感受态细胞bl21表达菌种的1.5mlep管中，冰浴30min；

2)于42℃干热器热击90s，再冰浴2min；

3)在超净台内，向ep管中加入200ul无抗生素的lb培养液后，于37℃、220rpm摇床复苏培养1小时；

4)将上一步产物3500rpm、室温、3min离心；

5)弃上清100ul，其余成分轻轻吹打混匀，均匀涂布到含50ug/ml的卡那霉素的lb平板上，用灭菌玻璃珠均匀涂布；

6)标记平板后，倒置放入37℃培养箱，过夜培养；

7)次日，在超净台内挑取单克隆菌落放入15ml含50ug/ml卡那霉素的lb培养液中，37℃、220rpm，过夜培养；

8)取10ml过夜培养菌液加入500mllb(含50ug/ml卡那霉素)，于220rpm、37℃培养约4h后测od600。如果od600在0.4-0.6之间，则取200ml菌液加入480uliptg，另外的200ml原菌不加iptg做对照，两瓶一起在37℃、220rpm过夜诱导表达；

9)于4℃、12000g、10min条件离心，收集菌体；

10)加入200mlpbs重悬菌体，冰预下按此条件超声：#6变幅杆、2s超声、5s间歇、30％功率、总时间30min；

11)超声后，于4℃、12000g、10min条件离心；

12)收集离心后的上清约200ml，并保留沉淀。取少量上清和沉淀用于sds-page分析。结果表明，表达的蛋白基本上都在沉淀里(图2a)。

13)用8m尿素溶解沉淀后，通过透析是使蛋白质复性，然后经ni柱子进行亲和纯化目的蛋白，所得到的穿透液、洗涤液、洗脱液用sds-page进行分析鉴定。

4.小鼠免疫及抗体的制备

(1)制备抗原溶液

经bca法，测得纯化抗原溶液flab浓度为0.5ug/ul。免疫一只小鼠需40ugflab蛋白。因此，取80ulflab蛋白溶液与等体积quickantibody-mouse5w免疫佐剂混合均匀后，再加入40ulpbs溶液使其体积为200ul。

(2)免疫小鼠

免疫前，从小鼠尾巴采血，分离血清作为免疫前血清(preim)。8-12周龄balb/c小鼠大腿用酒精棉球消毒后，左右大腿各进行肌肉注射一次，每针剂100ul。初次免疫21天后，以同样的方式加强免疫一次。

(3)免疫后小鼠血清采集

眼球取血。用手将小鼠固定，然后按压小鼠，摘除小鼠眼球。用ep管接近小鼠眼球部位接取血液。将血液移入37℃培养箱孵育1小时后，再于4℃放置过夜。第二天，于室温、8000g的条件下离心10分钟，吸取上清即为免疫血清(im)。

5.elisa方法分析抗体效价

用包被液(ph9.6的碳酸盐缓冲液)将抗原稀释为5ug/ml。于96孔板每孔加入100ul稀释的抗原，于4℃包被过夜。第二天弃去孔中包被液，用pbst洗涤3次，每次5分钟。每孔加入200ul的封闭液，于37℃水浴锅中封闭2h。然后用pbst洗板3次，每次5min。每孔加入100ul的梯度稀释的免疫后血清，阴性对照为免疫前的小鼠血清，pbs作为空白对照。于37℃水浴锅中孵育1小时，再用pbst洗板3次，每次5min。每孔加入100ul由5％封闭液稀释的1：5000anti-mouselgg-hrp抗体，于37℃水浴锅孵育1小时。用pbst洗板3次，每次5min后。每孔加入100ul显色液，室温避光显色30min。每孔加入100ul2mol/lh2so4终止反应，立即测定450nm波长处的od值，计算免疫后血清od值与免疫前血清od值之间的比值，p/n≥2.0即为阳性。

6.抗flab抗体在螺旋体检测分析中的应用

通过elisa检测螺旋体。从-80度分别取出1管冻存的螺旋体(5251和4680)，解冻后于132000rpm室温离心6分钟，使细菌沉淀下来后，用500ulpbs悬浮细菌沉淀。经42度灭活1小时后，用pbs稀释细菌浓度至50000个/100ul。取100ul细菌悬液包被96孔板，4度过夜。抗flab抗体经倍比稀释后作为一抗进行elisa检测。一方面分析本研究制备的抗体是否可以通过elisa法检测5251原菌体，另一方面分析该抗体是否能与另一菌株4680的交叉反应程度。

通过western-blot检测螺旋体。1x10⁷个螺旋体于132000rpm室温离心6分钟，使细菌沉淀下来后，用200ulpbs悬浮细菌沉淀。加入40ul的6x上样缓冲液，混匀后于100度煮沸10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清即为蛋白样品。蛋白样品经sds-page分离后，转移至pvdf膜。经封闭后，加1:250稀释的抗flab抗血清于4度孵育过夜。洗涤3次后，加1:3000稀释的anti-mouselgg-hpr抗体于室温孵育2小时。洗涤3次后，加显色液反应3min，于凝胶成像系统照相分析。

通过免疫荧光检测螺旋体。将3×10⁵个螺旋体用甲醇固定在载玻片上。用pbs润洗后，加200ul0.5％triton-100反应10min。再用pbs润洗后，加入1：250稀释的抗flab抗血清作为一抗，于4℃条件下过夜孵育。加alexafluor-488标记的抗鼠igg抗体后，于室温孵育1小时。孵育结束后，用dapi染核酸和封片，于荧光显微镜下检测分析。

三、研究结果分析

1.获取flab基因和构建原核表达重组质粒：

1)用于引物设计的参考序列：borreliahermsiihs1isolatebrownemountain,completecdsofflab,genbank:cp014349.1

atgatcataaatcataatacgtcagctataaatgcttcaagaaataatagcattaatgctactaatcttagcaaaactcaagaaaaactttctagtgggcatagaattaatcgtgcatctgatgatgctgctggtatgggcgttgctggaaaaattaatgctcaaattagagggttgtctcaggcttctagaaatacttcaaaggctataaattttattcaaacaacagaaggaaatttaaatgaagtagagagagtattagtaagaatgaaagaacttgctgttcaatctggtaatggtacatattcagatgcagacagaggttctattcaaattgaaattgagcaacttacagatgaaatcaacagaattgctgatcaggctcaatacaaccaaatgcatatgttgtccaacaagtcagctgctcaaaatgtaaaaacagctgaagagcttggaatgcaacccgcaaaaattaacacaccagcatcactagctggatcacaagcttcatggacattgagagtacatgtgggcgcaaatcaggatgaggcaattgctgttaatatttatgcatctaatgttgcaaatctttttgcaggtgaaggcgctcaggctgctccagtgcaagagataggacagcaagaggaaggtcaagcagctccagctccagcagcagctccagctcaaggtggagttaattccccaattaatgttacaaccgctgttgatgctaatatgtcacttgcaaagatagagggtgctattaggatggtaagtgatcaaagagcaaatcttggtgctttccaaaacagacttgagtctattaaggatagtacagaatatgctattgaaaacttgaaagcatcatatgctcaaattaaagatgcaacaatgacagatgaagttgtagcatcaacaactcacagtattttgacacaatctgcaatggctatgattgcacaagcaaatcaagtacctcaatatgtattatcattgcttagataa

2)用ndei、xhoi酶切pet-30a后，切掉n端his.tag，保留c端的his.tag，酶切过后克隆位点两端的序列为：

3)根据基因的参考序列1)和载体酶切后克隆位点两端的序列2)设计引物(见材料“引物”)：其中15bp与载体互补配对，另外21bp与目的基因互补配对；

4)利用设计的引物，设置不同的退火温度进行pcr扩增目的基因，结果发现：只有在49.7度能扩增出特异性条带，大小约1000bp(图1)，与预期大小符合。

5)目的片段经纯化后，通过in-fusion方式克隆至载体pet-30a中，测序验证结果表明，目的基因被成功克隆到原核表达载体pet-30a。

本研究测得flab基因的序列：

atgatcataaatcataatacgtcagctataaatgcttcaagaaataatagcattaatgctactaatcttagcaaaactcaagaaaaactttctagtgggcatagaattaatcgtgcatctgatgatgctgctggtatgggcgttgctggaaaaattaatgctcaaattagagggttgtctcaggcttctagaaatacttcaaaggctataaattttattcaaacaacagaaggaaatttaaatgaagtagagagagtattagtaagaatgaaagaacttgctgttcaatctggtaatggtacatattcagatgcagacagaggttctattcaaattgaaattgagcaacttacagatgaaatcaacagaattgctgatcaggctcaatacaaccaaatgcatatgttgtccaacaagtcagctgctcaaaatgtaaaaacagctgaagagcttggaatgcaacctgcaaaaattaacacaccagcatcactagctggatcacaagcttcatggacattgagagtacatgtgggcgcaaatcaggatgaggcaattgctgttaatatttatgcatctaatgttgcaaatctttttgcaggtgaaggcgctcaggctgctccagtgcaagagataggacagcaagaggaaggtcaagcagctccagctccagcagcagctccagctcaaggtggagttaattccccaattaatgttacaaccgctgttgatgctaatatgtcacttgcaaagatagaaggtgctattagaatggtaactgatcaaagagcaaatcttggtgctttccaaaacagacttgagtctattaaggatagtacagaatatgctattgaaaacttgaaagcatcatatgctcaaattaaagatgcaacaatgacagatgaagttgtagcatcaacaactcacagtattttgacacaatctgcaatggctatgattgcacaagcaaatcaagtacctcaatatgtattatcattgcttagactcgagcaccaccaccaccaccactga

2.flab重组蛋白的表达与纯化：含重组质粒pet30a-flab大肠杆菌经0.5mm的iptg诱导表达后，sds-page分析发现，在34-43kda之间的沉淀组分里有明显的表达蛋白，提示目的蛋白可能绝大部分以包涵体的形式表达。用抗his标签的抗体进行westernblot鉴定，结果表明位于在34-43kda之间表达的蛋白是我们需要的融合蛋白flab-his(图2a)。接下来，我们对包涵体里的蛋白按前面描述的方法进行纯化，最后通过30mm和300mm的咪唑将目的蛋白洗脱下来，sds-page分析结果显示，我们得到了纯度较高的蛋白(图2b)。

3.抗flab抗体制备与效价分析：按每只小鼠40ug蛋白的剂量，通过5周2次免疫的程序制备抗体。用免疫的抗原蛋白包被elisa板，分析血清中抗flab的抗体效价。elisa检测结果表明，抗flab血清的效价为1:2048k(图3)。

4.抗flab抗体的应用研究：为了验证该抗体的广谱性，我们选用了2株不同的螺旋体(5251和4680)进行了以下应用研究。首先通过westernblot验证该抗体是否能与螺旋体的蛋白反应。结果表明，该抗体能与这2株螺旋体的蛋白结合，大小与flab大小(约40kda)相符。其次，我们以这2株螺旋体包被elisa板，用进行了一系列稀释的该抗体进行分析。结果发现，该抗体也能同时检测这2株螺旋体，且效价都在1:3200以上(图4b)。最后，我们通过免疫荧光的方法，用该抗体检测这2株螺旋体。结果表明，该抗体不但能特异性结合回归热螺旋体5251，也能结合莱姆病疾病螺旋体4680(图4c)。

综上所述，本研究成功地表达和获得了较高纯度的螺旋体flab蛋白，并制备了高效价的抗体，能用于westernblot、elisa和免疫荧光方法分析和检测回归热螺旋体和莱姆病疾病螺旋体。