原位制备抗菌性细菌纤维素膜的方法与流程

本发明涉及一种原位制备抗菌性细菌纤维素膜的方法，属于抗菌材料技术领域。

背景技术

众所周知，在湿态敷料中，抗菌性是最重要的功能之一。一般的医用敷料都是在无纺布、尼龙等没有抗菌性的基体材料上面涂覆抗菌物质，从而达到抗菌的目的，抗菌物质一般使用的是银纳米颗粒。文献1(weib,yangg,hongf.preparationandevaluationofakindofbacterialcellulosedryfilmswithantibacterialproperties[j].carbohydratepolymers,2011,84(1):533-538.)是将细菌纤维素膜冷冻干燥后，浸泡在苯扎氯铵溶液中以达到抗菌的目的，但是由于抗菌剂是物理吸附进去的，所以该医用敷料抗菌的稳定性并不好，受限于储存时间，浓度等。文献2(xiujuzhang,yingfang,wenbinchen.preparationofsilver/bacterialcellulosecompositemembraneandstudyonitsantimicrobialactivity[j].synthesisandreactivityininorganicandmetal-organicchemistry,2013,43(7):907-913.)是将细菌纤维素浸泡在高浓度的硝酸银溶液中，然后还原银，制备了ag/bc复合膜，具有良好的抗菌效果，但是造价昂贵，银颗粒容易脱落的缺点也是难以避免的。

技术实现要素：

针对现有的医用敷料成本高，制备复杂的不足，本发明提供了一种原位制备抗菌性细菌纤维素膜的方法。该方法将桑叶用碱提酸沉淀的方法制备出桑叶蛋白，并将剩余的残渣用稀硫酸水解成单糖，混合后成为桑叶水解液。以桑叶水解液为碳、氮源制备抗菌性的细菌纤维素膜。

本发明的技术方案如下：

原位制备抗菌性细菌纤维素膜的方法，将桑叶水解成为桑叶水解液，以其作为碳、氮源制备细菌纤维素，并将细菌纤维素纯化，具体步骤如下：

步骤1，将桑叶置于4～6g/lnaoh溶液中，超声混合均匀，并40～60℃下水浴，离心，收集上清液和固体残渣；

步骤2，hcl溶液调节上清液的ph至3±0.2，将产生的沉淀清洗后冷冻干燥，得到桑叶蛋白，将桑叶蛋白加入到6～7mol/lhcl溶液中溶解，过滤，中和，得到桑叶蛋白水解液；

步骤3，将固体残渣加入质量浓度为2％～15％的h2so4中，80～120℃酸解1～5h，离心后，将ca(oh)2加入到上清液中，调至ph＝10±0.5，进行脱毒，脱毒后离心，在上清液中加入h2so4溶液，调至ph＝6±0.5，并加入0.1～0.2g/lna2so3，煮沸5～10分钟后离心，在上清液中加入活性炭吸附，离心浓缩后得到桑叶纤维水解液；

步骤4，将桑叶蛋白水解液与桑叶纤维水解液混合得到混合桑叶水解液，按桑叶的质量与发酵培养基的体积的比为20～25:100，g：ml，以混合桑叶水解液为原料配制发酵培养基，接种木醋杆菌，发酵，发酵结束后，水中浸泡除去残余培养基成分，得到抗菌性细菌纤维素膜。

优选地，步骤1中，所述的naoh溶液的浓度为4～5g/l。

优选地，步骤1中，所述的超声时间为20min以上。

优选地，步骤1中，所述的水浴时间为1～2h，离心时间为15min以上。

优选地，步骤3中，所述的h2so4溶液的浓度为7％～15％。

优选地，步骤3中，所述的酸解温度为100℃，所述的酸解时间为1.5h。

优选地，步骤4中，所述的发酵培养基为每100ml桑叶水解液，加入硫酸铵0.10g，磷酸二氢钾0.50g，硫酸镁0.07g，乳酸钙0.02g，冰乙酸0.15g，柠檬酸0.06g，羧甲基纤维素钠0.04g，调ph＝6.0。

优选地，步骤4中，发酵培养14天。

本发明以用碱提酸沉淀的方法制备出桑叶蛋白，并将剩余的残渣用稀硫酸水解成单糖，混合后成含有抗菌物质的桑叶水解液，再以桑叶水解液为碳源和氮源和抗菌物质，原位制备了具有抗菌性的细菌纤维素膜。本发明方法简单，成本低，抗菌性稳定，可以广泛应用在医用敷料上。

说明书附图

图1是传统方法制备的细菌纤维素膜(la-bc)和实施例1中用桑叶水解液制备的细菌纤维素膜(mh-bc)的红外光谱图。

图2是la-bc和实施例1中所制得的mh-bc的sem图。

图3是la-bc和实施例1中所制得的mh-bc的xrd图。

图4是la-bc和实施例1中所制得的mh-bcd抗菌效果图。

图5是la-bc和实施例1中所制得的mh-bc的菌容浓度od600图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

现有实验室的发酵培养基的配方(w/v，g/100ml)：葡萄糖2.25，蔗糖2.75，蛋白胨1.00，酵母浸粉0.75，硫酸铵0.10，磷酸二氢钾0.50，硫酸镁0.07，乳酸钙0.02，冰乙酸0.15，柠檬酸0.06，羧甲基纤维素钠0.04，调ph＝6.0，高温灭菌后接种acetobacterxylinumnust4.2。

实施例1

桑叶水解液的制备：

将桑叶粉碎后过60目筛，置于5g/lnaoh溶液中，超声20min，并45℃下水浴1h，离心15分钟，分别收集上清液和固体残渣；将上清液与1mol/lhcl混合，调至ph＝3，将所产生的沉淀清洗后冷冻干燥，得到桑叶蛋白。将桑叶蛋白加入到6mol/lhcl中，过滤，中和，得到桑叶蛋白水解液。将固体残渣加入7％的h2so4中，100℃酸解1.5h，离心后将ca(oh)2加入到上清液中，调至ph＝10，进行脱毒，脱毒后离心，在上清液中加入5mol/lh2so4，调至ph＝6，并加入0.1g/lna2so3，煮沸5分钟后离心，在上清液中加入少量活性炭，吸附12h，离心浓缩后得到桑叶纤维水解液。将两部分水解液混合即得桑叶水解液。

抗菌性细菌纤维素膜的制备与纯化：

取桑叶水解液100ml，加入硫酸铵0.10g，磷酸二氢钾0.50g，硫酸镁0.07g，乳酸钙0.02g，冰乙酸0.15g，柠檬酸0.06g，羧甲基纤维素钠0.04g，调ph＝6.0，高温灭菌后接种acetobacterxylinumnust4.2，发酵培养14天。将制备的细菌纤维素膜取出，浸泡在清水中浸泡48h，每两小时换一次水，将凝胶状膜中的残余培养基成分置换出来。即得具有抗菌性的细菌纤维素膜。

由图1的傅里叶变换红外(ft-ir)中可以看到，桑叶水解液制备的细菌纤维素膜(mh-bc)具有本实验室配方制备的细菌纤维素膜(la-bc)的特征峰。在3340cm^-1处为-oh的伸缩振动吸收峰，峰带宽而且强，说明两者表面都含有大量的-oh；2910cm^-1处为细菌纤维素的c-h伸缩振动峰；1650cm^-1处是由于糖类物质4′端的半缩醛基团引起的；1425cm^-1处的吸收峰为-ch2-的对称弯曲振动峰；1040cm^-1处的吸收峰为糖环的c-o-c和c-o-h的伸缩振动峰，而890cm^-1处的吸收峰则为纤维素β-1,4糖苷键的特征吸收峰。不同的是，mh-bc在1650-1040cm^-1之间出现了许多尖锐的新峰，主要的吸收峰有：1600cm^-1以及1500cm^-1处为苯环骨架的特征吸收峰，1170cm^-1为苯环上c-o-h的吸收峰，另外，mh-bc在1650cm^-1的峰型比la-bc在此处的峰型尖锐，强度大，猜测可能是水解液中黄酮类物质含有的c＝o所致。

图2中(a)和(c)分别为la-bc和mh-bc的sem图，从图中可以看到两者都具有由错综复杂的纤维相互缠绕而形成的三维网状结构，低倍数下观察到的bc形貌主要是由纤维丝带杂乱无章地相互缠绕在一起，不同的是图(c)中纤维丝带较图(a)疏松，而且图(c)中有些空隙被覆盖掉；高倍数下观察到的主要是两者纤维丝带层状重叠，而且都存在很多明显的孔洞结构，同时可以得出图(c)中mh-bc纤维直径明显要粗于图(a)中la-bc纤维直径，图(a)中la-bc纤维直径约为60nm，而图(c)中mh-bc纤维直径约为200nm，此外图(c)中mh-bc的网孔直径明显比图(a)中la-bc的网孔直径大，这可能是由于桑叶水解液中存在的黄酮类物质具有的抑菌性导致其分泌的纤维丝带之间作用力较弱所引起的。

图3为mh-bc和la-bc的xrd图。mh-bc和la-bc衍射角的顶点14.65°，16.93°和14.65°，10.75°的衍射角，而12.41°和27.39°的峰只有mh-bc具有。由此可见，mh-bc不仅包含细菌纤维素的特征峰，还具有黄酮类化合物的特征峰。

在图4中，可以看到在固体琼脂培养基上mh-bc的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌出现明显的抑菌圈，而空白对照组和la-bc的培养基上两类细菌生长良好，这意味着la-bc没有抗菌性。同时，可以看到mh-bc显示出对两种细菌不同的抗菌性，mh-bc涂有金黄色葡萄球菌的培养基与大肠杆菌相比有更大的抑菌圈，显示mh-bc对革兰氏阳性细菌具有更好的抗菌能力。而采用的发酵菌株是一种革兰氏阴性细菌，这在一定程度上抑制发酵过程中的污染率和提高发酵成功的机会。

图5所示，mh-bc的细菌悬液的od600在6h时是最低的，它显示了mh-bc具有很高的抗菌效率。当时间延长到12h，mh-bc的od600百分比增加细菌悬液低于另外两个，并且含有金黄色葡萄球菌的od600是最低的。这表明mh-bc具有连续的抗菌性能。此外，mh-bc经12h培养后细菌悬液的od600百分比增加值金黄色葡萄球菌(0.43)低于大肠杆菌(0.52)，显示出mh-bc对革兰氏阳性细菌具有更好的抗菌性能。

实施例1～10的反应条件和还原糖得率见表1。

表1

表1为不同反应条件下水解还原糖的得率。从表中可以看出，本发明实施例1制得的桑叶水解液还原糖含量最高。