绿色荧光蛋白基纳米粒子、制备方法及其在细胞成像和细胞核核仁染色方面的应用与流程

本发明属于荧光蛋白基纳米材料领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白基纳米粒子、制备方法及其在细胞成像和细胞核核仁染色方面的应用。

背景技术

近年来，各种具有不同功能和性质的纳米材料在设计、制造上都取得了很大的进展。大部分被开发出来的纳米材料(半导体量子点、荧光碳点、冷光硅纳米粒子、有机小分子和有机荧光纳米粒子等)被用于生物成像、药物递送等有关医学诊断、治疗方面的应用。但同时，这些材料的应用受到了不同程度的限制，比如说，缺失关键的生物相容性、对生物体的毒性大、合成路线复杂、成本高昂、不易全面推广等等。

细胞核核仁是细胞中的重要组成部分，扮演着核糖体rna转录、加工、装配场所的角色。核仁的可视化对于核仁及其相关生化反应的研究具有重要的意义。尤其是，在活细胞中对核仁的定位保持了细胞的正常生理特性，更加有助于实时地监控核仁的情况。然而，目前大多数的核仁染料不具备对活细胞核仁定位的功能，均需要通过复杂的流程将细胞固定后染色。在固定的过程中，很可能失去或者改变更多的生物体信息。使用最多的核仁染色方法需要使用针对核仁某一组分的抗体。例如，在细胞中引入抗纤维蛋白素单克隆抗体，用来对核仁进行定位。这种方法的一个优点是抗体对其抗原的特异性，使研究人员能够检测出有针对性的生物分子或过程。然而，这个过程需要一个特定的抗体，这类抗体通常是昂贵的，往往不是市售的，而且仍然需要将另一个染料结合在抗体上。所以，整体评价这种方法是复杂，昂贵的。不利于科学实验的快速推动。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种绿色荧光蛋白基纳米粒子、制备方法及其在细胞成像和细胞核核仁染色方面的应用。本发明首先是利用一步合成法制备绿色荧光蛋白基纳米粒子，然后对活细胞成像和核仁进行染色定位。

本发明制备的绿色荧光蛋白基纳米粒子生物相容性很好，利用其低毒性的特点与活细胞共同孵育可以实现细胞核核仁定位的目的，且荧光性质稳定存在十小时以上。

本发明所述的绿色荧光蛋白基纳米粒子的制备方法及其对细胞成像和细胞核核仁染色的步骤如下：

1)在去离子水中，加入浓度为0.01～1mol/l(优选为0.1～1mol/l)的硫磺素-t(tht)水溶液作为构筑分子，再加入浓度为0.01～1mol/l(优选为0.1～1mol/l)的牛血清白蛋白(bsa)或人血清白蛋白水溶液，硫磺素-t和牛血清白蛋白或人血清白蛋白的用量摩尔比为1：1，然后将该溶液在50～100℃(优选为80～100℃)的温度下加热5～20min，最后将溶液冷却至室温，从而得到本发明所述的绿色荧光蛋白基纳米粒子溶液，绿色荧光蛋白基纳米粒子的浓度为0.64～64mg/ml。

2)将酿酒酵母细胞用ypd(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)作为培养基，在30℃恒温震荡器中于振荡下孵育直至od600达到1.0；取1ml细胞培养液离心收集酿酒酵母细胞，所得细胞菌株用新鲜ypd洗涤3次，然后将细胞重悬于100μl、含0.1mg/ml绿色荧光蛋白基纳米粒子的ypd培养基中，重新放回30℃恒温震荡器中孵育6小时；再取1ml细胞培养液离心收集酿酒酵母细胞，所得细胞菌株用pbs缓冲液(ph7.4)重悬3～5次，尽可能洗去培养基和体外的荧光纳米粒子，以避免对共聚焦成像时的背景干扰；最后将2μl重悬液滴在载玻片上，作为细胞成像的样品；

3)将hela细胞接种在盖玻片上，在dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)中培养，3天更换一次培养液，控制培养箱环境为37℃和5％co2；将培养后的上述hela细胞接种在含有1mg/mlt-fpns的dmem培养基的盖玻片上培养1小时，之后使用新的盖玻片轻轻盖住生长有hela细胞的盖玻片放入成像室中，用hank's平衡盐溶液(hbss)洗涤2次并保持在hbss中；最后使用zeisslsm700共焦显微镜进行成像，所述共焦显微镜配备有由zen软件控制的100x油物镜(na1.4)，488nm和555激光，观察对细胞核核仁染色的效果。

硫黄素-t(tht)穿插于牛血清白蛋白(bsa)骨架中，合成了新的发射峰在绿光区域的绿色荧光蛋白基纳米粒子t-fpns，在酵母细胞中与hela细胞的实验中显示t-fpns可以做为生物成像材料和核仁定位染料。本发明制备的绿色荧光蛋白基纳米粒子适合大规模生产，因为它们的合成方法具有低成本效益、环保、简便和生物相容性的特点。并且具有优异光稳定性的t-fpns可染色活细胞和定位活细胞的核仁，实现快速，实时和无清洗成像。

附图说明

图1：图1(曲线2)是实施例1所制备的荧光纳米粒子的荧光发射谱曲线；

将制备的荧光纳米粒子装到比色皿中，在荧光光谱仪中，设置发射波长为400nm，可以检测到在488nm处有较强的发射峰。图1(曲线3)，图1(曲线1)分别是合成纳米粒子所需的组成成分硫黄素-t和牛血清白蛋白，他们在相同波长的激发下没有相应的发射峰。

图2：图2是实施例1所制备的荧光纳米粒子对酵母细胞的染色图。从对细胞的拍摄结果看，当在酵母细胞培养基中加入荧光纳米粒子共同孵育后，细胞呈现绿色。左图是绿色荧光通道图像，中间是复合图像，右边是明场图像(荧光共聚焦显微镜会直接给出三个不同通道的图像，分别是相应颜色通道图像，复合图像和明场图像)。

图3：实施例1所制备的荧光纳米粒子对hela细胞核仁定位的成像。在hela细胞中加入荧光纳米粒子后，通过荧光共聚焦显微镜的检测，看到细胞内核仁的位置呈现强的绿色荧光。左边是绿色荧光通道图像，中间是复合图像，右边是明场图像。

具体实施方式

实施例1：

在0.8ml去离子水中，加入浓度为1mol/l的硫磺素-t水溶液0.1ml作为构筑分子，加入浓度1mol/l的牛血清白蛋白水溶液0.1ml，硫磺素-t和牛血清白蛋白的用量摩尔比为1：1。然后将溶液在100℃的温度下加热10min，最后将溶液冷却至室温，得到绿色荧光蛋白基纳米粒子溶液，荧光蛋白基纳米粒子的浓度为6.4mg/ml。

实施例2：

酿酒酵母细胞用ypd(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)作为培养基，在30℃下振荡孵育直至od600达到1.0；取1ml细胞培养液离心收集酿酒酵母细胞，所得细胞菌株用新鲜ypd洗涤三次，然后将细胞重悬于实施例1得到的100μl含有0.1mg/ml绿色荧光蛋白基纳米粒子的ypd培养基中，然后重新放回30℃的恒温震荡器中孵育6小时；再取1ml细胞培养液离心收集酿酒酵母细胞，所得细胞菌株用pbs缓冲液(ph7.4)重悬3～5次，尽可能洗去培养基和体外的荧光纳米粒子，以避免对共聚焦成像时的背景干扰；最后将2μl重悬液滴在载玻片上，使用zeisslsm700共焦显微镜进行细胞成像研究。

实施例3：

将hela细胞接种在盖玻片上，在常规dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)中培养，3天更换一次培养液，控制培养箱环境为37℃和5％co2。荧光蛋白基纳米粒子对核仁的染色步骤如下，将上述培养后的hela细胞接种在含有1mgml^-1t-fpns的dmem盖玻片上培养1小时。之后，使用新的盖玻片轻轻盖住生长有细胞的盖玻片放入成像室中，用hank's平衡盐溶液(hbss)洗涤两次并保持在hbss中。最后使用zeisslsm700共焦显微镜进行成像，所述共焦显微镜配备有由zen软件控制的100x油物镜(na1.4)，488nm和555激光。用于观察对核仁染色的效果。