一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌的制作方法

本发明涉及一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程
技术领域：
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背景技术：
α-淀粉酶(α-amylase，ec.3.2.1.1)是一种重要的糖苷水解酶，其具有广泛的底物偏好性以及产物特异性，能切断淀粉以及相关α-葡聚糖分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖，同时，其能够保留产物的α-异构体构象。因此，α-淀粉酶被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药等行业。根据作用温度的不同，α-淀粉酶也可分为高温、中温和低温α-淀粉酶。其中，高温α-淀粉酶具有良好的热稳定性，且来源广泛，可以从植物、动物和微生物中提取得到。植物、动物和微生物来源的α-淀粉酶中，微生物来源的高温α-淀粉酶在生产成本、发酵稳定性和生产时间等方面均比其他来源的有更明显的优势；而在微生物来源的高温α-淀粉酶中，细菌来源的高温α-淀粉酶热稳定性优势更为明显。因此，来源于细菌的高温α-淀粉酶具有巨大的应用前景。目前，已经有很多文献研究了来源于不同细菌的高温α-淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌中异源表达的情况。高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达量比在枯草芽孢杆菌中的高，但由于大肠杆菌在进行发酵产酶的过程中会产生内毒素等有害物质，对人体不利，大大限制了其应用；而枯草芽孢杆菌的细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株gras(generallyrecognizedassafe)，但高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达的表达量与活性十分低。上述缺陷均使得来源于细菌的高温α-淀粉酶在工业上难以得到广泛的应用。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。此枯草芽孢杆菌工程菌以phy300plk为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5为表达宿主，并在目的基因的上游插入了信号肽基因。利用此枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α-淀粉酶，将其作为生产菌株，发酵48h，可将发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至732.1u/ml。本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽基因以及表达载体；所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述信号肽基因的核苷酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8；所述表达载体为phy300plk；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因。在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的核苷酸序列为seqidno.9。在本发明的一种实施方式中，所述目的基因的酶切位点为saci和hindiii。在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因为来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168的信号肽基因。在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因插入在目的基因的上游。在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因的酶切位点为mlui和eco52i。在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285；所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5记载于公开号为cn106754466a，申请号为201611025858.9的专利文本中。本发明提供了一种生产α-淀粉酶的方法，所述方法为使用上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中培养。在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h。在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为的成分包含8～12g/l的蛋白胨、4～6g/l的酵母粉以及8～12g/l的氯化钠。在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含20～25g/l的酵母浸膏、5～10g/l的大豆蛋白胨以及4～6g/l的甘油；所述发酵培养基的初始ph为6～7。本发明提供了应用上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或上述一种生产α-淀粉酶的方法制备得到的α-淀粉酶。本发明提供了上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或上述一种生产α-淀粉酶的方法在制备α-淀粉酶、水解淀粉、制备糊精、制备低聚糖、制备麦芽糖以及制备葡萄糖方面的应用。有益效果：(1)本发明以phy300plk为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5为表达宿主并在目的基因的上游插入了信号肽基因，得到了一种可高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌；(2)利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌生产α-淀粉酶，发酵48h，可将三角摇瓶发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至732.1u/ml；(3)利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌生产α-淀粉酶，发酵原料来源广泛，同时，生产成本较低。附图说明图1为重组质粒phy-spamye-amys构建流程图；图2为重组质粒phy-spamye-amys的quickcuttmhindiii酶切验证结果；其中，m为dl1000dnamarker，泳道1为phy-spamye-amysquickcuttmhindiii酶切条带；图3为重组质粒phy-spyojl-amys构建流程图；图4为重组质粒phy-spyojl-amyspcr验证图；其中，m为dl500dnamarker，泳道1为phy-spyojl-amyspcr扩增条带；图5为含有重组质粒phy-spyojl-amys的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵sds-page电泳图；其中，m为中分子量标准蛋白，泳道1为bacillussubtilisws5/phy-spyojl-amys摇瓶发酵上清条带。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5记载于公开号为cn106754466a，申请号为201611025858.9的专利文本中，且已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285购自takara公司(宝生物工程(大连)有限公司)，产品型号：3380，b.subtilissecretoryproteinexpressionsystem。下述实施例中涉及的检测方法如下：酶活检测方法：将1ml的1％的可溶性淀粉溶液和0.9ml的20mm、ph6.0的磷酸缓冲液充分混匀，在70℃预热10min，加入0.1ml粗酶液，振荡混匀，反应5min后加入3mldns，振荡，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进行同样操作作为空白)。在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1umol葡萄糖所需酶量为一个淀粉水解活力单位。下述实施例中所涉及的培养基如下：种子培养基：8～12g/l的蛋白胨、4～6g/l的酵母粉以及8～12g/l的氯化钠。发酵培养基：20～25g/l的酵母浸膏、5～10g/l的大豆蛋白胨以及4～6g/l的甘油，初始ph为6～7。lb固体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏5、10g/l的nacl、0.2g/l的琼脂粉。lb液体培养基：10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏5、10g/l的nacl。生长培养基：10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏5、10g/l的nacl、0.5m的山梨醇。电转缓冲液：0.5m的山梨醇、0.5m的甘露醇、10％的葡萄糖。复苏培养基rm：0.5m的山梨醇、0.38m的甘露醇、10g/l蛋白胨、5g/l的酵母膏、10g/l的nacl。实施例1：构建重组载体phy-spamye-amys具体步骤如下(构建流程可参考图1)：(1)设计含有同源臂的引物amys-f、amys-r(seqidno.10、seqidno.11)，以重组载体pet20b-amys为模板，pcr扩增出带有同源臂的amys，其中重组载体pet20b-amys为实验室保存(ref:lz,dx,wj.improvingthethermostabilityandenhancingtheca2+bindingofthemaltohexaose-formingα-amylasefrombacillusstearothermophilus.journalofbiotechnology.2016；222:65–72.)。(2)设计引物phy-f、phy-r(seqidno.12、seqidno.13)，以重组载体phy300plk-β-cgtase为模板，pcr扩增出载体phy-spamye(此处信号肽spamye为载体phy自带的信号肽，其核苷酸序列为seqidno.1)，其中重组载体phy300plk-β-cgtase为实验室保存(ref:zhang,k.,duan,x.,wu,j.2016.multigenedisruptioninundomesticatedbacillussubtilisatcc6051ausingthecrispr/cas9system.scientificreports,6.bacillussubtilis)。引物序列见表1：表1引物序列注：划线部分为同源臂序列。pcr体系见表2：表2pcr反应体系5xphusionhfreactionbuffer10.0μldntp4.0μlpet20b-amys/phy300-β-cgtase0.5μlamys-f/phy-f0.5μlamys-r/phy-r0.5μlprimerstardna0.5μlddh2oupto50μlpcr条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，pcr产物进行胶回收。(3)将(1)、(2)中扩增出且已回收的两段片段根据hcloningkit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接后将连接产物转入e.colijm109感受态细胞，涂板后于37℃过夜培养；连接体系见表3：表3hdcloningkit试剂盒连接体系体系组分组分用量5xin-fusionhdenzymepremix2.0μlphy-spamye1.2μlamys3.5μlddh2o3.3μl连接条件：50℃，25min。(4)从过夜培养的平板上挑单菌落，接lb液体培养基于37℃，200rpm下培养8～10h后提质粒进行quickcuttmhindiii酶切验证(验证结果见图2)，酶切验证成功即得重组载体phy-spamye-amys。酶切体系见表4：表4quickcuttmhindiii酶切体系酶切成分酶用量quickcuttmhindiii0.2μl10×quickcutgreenbuffer1.0μlphy-spamye-amys2.0μlddh2o6.8μl酶切条件：37℃酶切反应20min。实施例2：构建带有不同信号肽的重组载体将编码来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168的信号肽spyojl(核苷酸序列为seqidno.2)、sprpmg(核苷酸序列为seqidno.3)、spaspb(核苷酸序列为seqidno.4)、spnpre(核苷酸序列为seqidno.5)、spapre(核苷酸序列为seqidno.6)、spyqxi(核苷酸序列为seqidno.7)、spywgb(核苷酸序列为seqidno.8)的基因与实施例1中构建的连有高温α-淀粉酶的表达载体进行重组(构建流程可参考图3)，具体步骤如下：(1)用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168，在lb固体培养基上划线，37℃过夜培养，挑单菌落用10μl的无菌的蒸馏水稀释，得到稀释后的菌液；(2)设计含有同源臂的引物yojl-f、yojl-r(seqidno.14、seqidno.15)，以(1)中得到的稀释后的菌液为模板扩增出spyojl信号肽；(3)用接种环沾取冻存的e.colijm109/phy-spamye-amys，在lb固体培养基上划线，37℃过夜培养，挑单菌落用10μl的无菌的蒸馏水稀释，得到稀释后的菌液；(4)设计引物p-f、p-r(seqidno.28、seqidno.29)，以(3)中得到的稀释后的菌液为模板扩增出phy-amys表达载体序列；引物序列如表5-6：表5引物序列表6引物序列注：划线部分为同源臂序列。pcr体系见表7：表7pcr反应体系5xphusionhfreactionbuffer10μldntp4.0μl菌液0.5μlpcr引物f0.5μlpcr引物r0.5μlprimerstardna0.5μlddh2oupto50μlpcr条件：94℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，pcr产物进行胶回收。(4)将(2)、(3)中扩增出且已回收的两端片段根据hdcloningkit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接；连接体系见表8：表8hdcloningkit试剂盒连接体系:体系组分组分用量5xin-fusionhdenzymepremix2.0μlphy-amys5.0μl信号肽2.0μlddh2oupto10μl连体条件：50℃酶切反应25min。sprpmg、spaspb、spnpre、spapre、spyqxi、spywgb信号肽的重组构建同(1)-(4)，引物分别为rpmg-f、rpmg-r(seqidno.16、seqidno.17)及aspb-f、aspb-r(seqidno.18、seqidno.19)；npre-f、npre-r(seqidno.20、seqidno.21)；apre-f、apre-r(seqidno.22、seqidno.23)；yqxi-f、yqxi-r(seqidno.24、seqidno.25)；ywgb-f、ywgb-r(seqidno.26、seqidno.27)延伸时间按照1kb/1min计算。(5)用(4)中构建的重组质粒转化e.colijm109感受态细胞后培养涂布lb固体培养基(含100μg/ml氨苄抗生素)，37℃培养过夜，待平板上长出单菌落，挑单菌落于lb液体培养基中培养8-10h后抽提质粒，因信号肽序列较小，因此，设计引物fyan-f、fyan-r(seqidno.30、seqidno.31)对信号肽进行pcr验证(验证结果见图4)，大小正确后对重组质粒测定dna序列，获得阳性克隆子即含有不同信号肽的重组载体phy-spyojl-amys、phy-sprpmg-amys、phy-spaspb-amys、phy-spnpre-amys、phy-spapre-amys、phy-spyqxi-amys、phy-spywgb-amys。实施例3：构建重组菌选取枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285作为宿主细胞，构建重组菌，具体步骤如下：(1)用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285，然后在lb平板上划线，37℃培养过夜活化；(2)从lb平板上挑步骤(1)的单菌落接种于5mllb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；(3)取2.5ml转接入40ml生长培养基，37℃，200rpm震荡培养4～5h；(4)将菌液冰浴10min，然后5000g，4℃，离心5min收集菌体；(5)用50ml预冷的电转缓冲液洗涤菌体，5000g，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次；(6)将洗涤后的菌体重悬于1ml电转缓冲液中，分装到1.5mlep管中，每管装200μl感受态细胞；(7)将200μl感受态细胞中分别加入10μl实施例1所得的重组质粒以及实施例2所得的带有不同信号肽重组质粒，冰浴18min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次；电转仪设置：2.4kv，25μf，200ω；(8)电击完毕后立即加入1ml复苏培养基rm缓慢吹吸混匀，37℃，200rpm，复苏3h后，涂含四环素抗性(50ug/ml)的平板，即得到分别含有重组载体phy-spyojl-amys、phy-sprpmg-amys、phy-spaspb-amys、phy-spnpre-amys、phy-spapre-amys、phy-spyqxi-amys、phy-spywgb-amys、phy-spamye-amys的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168以及枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285。实施例4：摇瓶发酵产酶及α-淀粉酶酶活的测定将实施例3中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，得到种子液，然后将种子液转接至发酵培养基中，于发酵培养基中于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h；发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液；(含有重组质粒phy-spyojl-amys的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵上清的sds-page电泳结果见图5)将得到的粗酶液进行酶活检测，检测结果为：含有重组载体phy-spyojl-amys、phy-sprpmg-amys、phy-spaspb-amys、phy-spnpre-amys、phy-spapre-amys、phy-spyqxi-amys、phy-spywgb-amys、phy-spamye-amys的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5的酶活分别为732.1u/ml、334.3u/ml、315.1u/ml、236.1u/ml、257.5u/ml、168.3u/ml、188.3u/ml、206.4u/ml；含有重组载体phy-spyojl-amys、phy-sprpmg-amys、phy-spaspb-amys、phy-spnpre-amys、phy-spapre-amys、phy-spyqxi-amys、phy-spywgb-amys、phy-spamye-amys的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168的酶活分别为328.3u/ml、314.3u/ml、215.1u/ml、206.1u/ml、148.3u/ml、128.4u/ml、126.6u/ml、152.4u/ml；含有重组载体phy-spyojl-amys、phy-sprpmg-amys、phy-spaspb-amys、phy-spnpre-amys、phy-spapre-amys、phy-spyqxi-amys、phy-spywgb-amys、phy-spamye-amys的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)k1285的分别酶活为328.6u/ml、204.2u/ml、165.3u/ml、136.1u/ml、127.5u/ml、108.3u/ml、106.3u/ml、122.4u/ml。由上述结果可知：连接有信号肽spyojl的枯草芽孢杆菌工程菌表达α-淀粉酶的活性最高，且用枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ws5表达α-淀粉酶的活性最高。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>江南大学<120>一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌<160>31<170>patentinversion3.3<210>1<211>78<212>dna<213>人工序列<400>1atgagaaaaaagattacgttagcatgcaagacatgcggaaaccgtaattatacgacaatg60aagagctctgcatcagcg78<210>2<211>78<212>dna<213>人工序列<400>2atgaaaaagaagattgtagccggcttggctgtttctgcagttgttgggtcgtcgatggcc60gcagcacccgcggaagca78<210>3<211>66<212>dna<213>人工序列<400>3atgaaactggcaaaaagagtatccgcattaacaccatcaaccacactggcaatcacagcg60aaagcg66<210>4<211>81<212>dna<213>人工序列<400>4atgggtttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatc60agcctgccaggtgttcaggct81<210>5<211>87<212>dna<213>人工序列<400>5atgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatg60gcgttcagcaacatgtctgtgcaggct87<210>6<211>87<212>dna<213>人工序列<400>6atgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctg60gcaggaggcgcaactcaagcgtttgcg87<210>7<211>72<212>dna<213>人工序列<400>7atgaaaatgaaatcaggaatggagcaggcggtttctgtgctgctgttactgtcacggctg60ccggtacaggct72<210>8<211>99<212>dna<213>人工序列<400>8atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgct99<210>9<211>1449<212>dna<213>人工序列<400>9atggcagccccgttcaatggcaccatgatgcagtacttcgagtggtacttaccggaccgc60ggtacactgtggaccaaagttgccaacgaggcaaacaacctgagcagcctgggcatcagc120gccttatggctgcctccggcctataaaggcaccagtcgtagtgacgtgggctatggcatg180tacgacctgtatgacttaggcgagttcaatcaaaagggcacagtgcgcaccaagtactgc240accaaggcccagtacctgcaagccattcaagccgcccacgccgcaggcatgcaagtgtat300gccgatgtggtgttcgatcacaagggcggcgccgatggtacagaatgggtggatgccgcg360gaggtgaacccgagcgaccgcaaccaggagattagcggcacctaccagatccaggcctgg420accaaattcgacttcccgggccgcggcaacacatacagcagcttcaagtggcgctggtac480cactttgatggcgtggattgggacgaaagccgtaagctgagccgcatctacaagtttcgt540ggcaaggcctgggactgggaggtggataccgagttcggtaactacgattacttaatgtat600gcagatctggacatggaccacccggaggtggtgaccgagttaaagaactggggtaaatgg660tatgttaacaccaccaatattgacggcttccgcctggacgccgttaagcatattaagttc720agcttcttccctgattggctgagctacgtgcgtagtcagacaggcaagcctctgtttagc780gtgggcgagtactggagctacgacattaacaagctgcataactacatcaccaagaccgac840ggcacaatgagcctgtttgatgcccctctgcacaacaagttctacaccgccagcaagact900ggtggtgcctttgacatgcgcaccctgatgaccaacaccctgatgaaagatcagccgacc960ctggccgtgaccttcgttgacaaccatgataccgagccggtgcaggcattacagagctag1020gtggacccttggtttaagcctctggcctacgccttcattctgacccgccaagagggttac1080ccgtgtgtgttctacggtgactactacggtattccgcaatataacattcctagcctgaag1140agcaagatcgacccgctgctgatcgcccgtcgtgactatgcctacggtacacagcacggc1200tatctggaccacagcgacatcattggctggacccgtgagggtggcaccgagaagcctgac1260agcggtttagcagcactgatcaccgacggccctggtggcagcaaatggatgtacgtgggc1320aagcagcatgccggcaaggtgttctatgacctgacaggcaatcgcagcgataccgtgacc1380atcaacagtgacggctggggcgaattcaaggttaatggtggcagcgtgagtgtgtgggtt1440ccgcgctaa1449<210>10<211>40<212>dna<213>人工序列<400>10tcaaataaggagtgtcaagaatggcagccccgttcaatgg40<210>11<211>41<212>dna<213>人工序列<400>11gtttttttattaccaagcttttagcgcggaacccacacact41<210>12<211>27<212>dna<213>人工序列<400>12tcttgacactccttatttgattttttg27<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列<400>13aagcttggtaataaaaaaacacctc25<210>14<211>42<212>dna<213>人工序列<400>14tcaaataaggagtgtcaagaatgaaaaagaagattgtagccg42<210>15<211>40<212>dna<213>人工序列<400>15ccattgaacggggctgccattgcttccgcgggtgctgcgg40<210>16<211>42<212>dna<213>人工序列<400>16tcaaataaggagtgtcaagaatgagaaaaaagattacgttag42<210>17<211>41<212>dna<213>人工序列<400>17ccattgaacggggctgccatcgctgatgcagagctcttcat41<210>18<211>42<212>dna<213>人工序列<400>18tcaaataaggagtgtcaagaatgaaactggcaaaaagagtat42<210>19<211>42<212>dna<213>人工序列<400>19ccattgaacggggctgccatcgctttcgctgtgattgccagt42<210>20<211>42<212>dna<213>人工序列<400>20tcaaataaggagtgtcaagaatgggtttaggtaagaaattgt42<210>21<211>41<212>dna<213>人工序列<400>21ccattgaacggggctgccatagcctgaacacctggcaggct41<210>22<211>43<212>dna<213>人工序列<400>22tcaaataaggagtgtcaagaatgagaagcaaaaaattgtggat43<210>23<211>43<212>dna<213>人工序列<400>23ccattgaacggggctgccatagcctgcacagacatgttgctga43<210>24<211>45<212>dna<213>人工序列<400>24tcaaataaggagtgtcaagaatgtttaagaaattacttttagcaa45<210>25<211>40<212>dna<213>人工序列<400>25ccattgaacggggctgccatagctttggcatgtccatcca40<210>26<211>44<212>dna<213>人工序列<400>26tcaaataaggagtgtcaagaatgaaaatgaaatcaggaatggag44<210>27<211>42<212>dna<213>人工序列<400>27ccattgaacggggctgccatagcctgtaccggcagccgtgac42<210>28<211>27<212>dna<213>人工序列<400>28tcttgacactccttatttgattttttg27<210>29<211>28<212>dna<213>人工序列<400>29atggcagccccgttcaatggcaccatga28<210>30<211>21<212>dna<213>人工序列<400>30atcaaataaggagtgtcaaga21<210>31<211>21<212>dna<213>人工序列<400>31gccattgaacggggctgccat21当前第1页12