本发明涉及一种防螨菌剂及其制备方法和应用，属于微生物技术防治
技术领域：
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背景技术：
螨虫属于节肢动物门蛛形纲广腹亚纲的一类体型微小的动物，身体大小一般0.5毫米左右，多数种类小于1毫米。目前已发现螨虫大约5万余种，仅次于昆虫。螨虫与人的健康密切相关，例如革螨、恙螨、疥螨、蠕螨、粉螨、尘螨和蒲螨等会侵入皮肤，吸食血液，引起蠕螨症、过敏症、尿路螨症、肺螨症、肠螨症和疥疮等症状，严重危害人类的身体健康。目前，传统方法是采用螨虫杀虫剂进行防治，而螨虫杀虫剂多数属于化学消毒剂，具有价格低廉的优势，但随之会引起损伤皮肤和污染环境等问题。因此，开发具有杀螨虫效果的生物杀虫剂是本领域中研发的一个重要方向。中国专利文献cn106221952a(申请号201610593891.5)公开了一种益生菌防螨家用纺织品洗涤剂及其洗涤方法。洗涤剂配方采用非化学成分，具有一定的杀虫除螨的效果。但没有说明具体益生菌，未考虑洗涤后的自来水排放是否环境友好。中国专利文献cn101475882a(申请号200910095675.8)公开了一种含有微生物的清洁剂及其制备方法。清洁剂主要由溶质、溶剂和芽孢杆菌组成，芽孢杆菌产生特定酶并且降解和消化有机废物，具有清洁和除臭效果，减少洗涤废水中的有机物含量，减轻废水后期处理成本。但是该专利仅公开了芽孢杆菌去污除臭功效，并没有涉及其抑菌和除螨功效。因此，针对上述现有技术中存在问题，研发既有良好抑菌除螨功效，又环境友好且成本低、对人体无害的生物型防螨益生菌菌剂，是长期以来本领域人员所要追求的目标。技术实现要素：针对现有技术的不足，本申请提供一种防螨菌剂及其制备方法和应用。本发明防螨菌剂尤其适用于防治与人体健康密切相关的螨虫，例如革螨、恙螨、疥螨、蠕螨、粉螨、尘螨和蒲螨等。本发明采用的技术方案如下：一种防螨菌剂，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，三者按照菌体数量比(1～3):1:1比例混合。优选地，所述枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌三者比例为2:1:1或3:1:1或1:1:1。更优选地，所述枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌三者比例为2:1:1。本发明防螨菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌分别接种于液体培养基i得到种子发酵液；(2)枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的种子发酵液分别转接于液体培养基ii，并收集芽孢；(3)将步骤(2)所收集的芽孢按照配方比例混合即得防螨菌剂。所述枯草芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，菌种编号为1.1413的枯草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，菌种编号为1.936的解淀粉芽孢杆菌；短小芽孢杆菌来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，菌种编号为1.4442的短小芽孢杆菌。所述步骤(1)中的液体培养基i组分及重量百分比为：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨0.7～1％，氯化钠0.5～1.2％，葡萄糖0.5～2％，ph7.0～7.2。所述步骤(1)中的活化培养条件为：将斜面保存的菌种接种于液体培养基i中，25～35℃，180转/分震荡培养14～16小时，即为种子发酵液。所述步骤(2)中的液体培养基ii组分及重量百分比为：氯化钠0.5～1.2％，蛋白胨0.7～1％，酵母膏0.5～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸铵0.3～0.5％，水余量，ph7.0～7.2。所述步骤(2)中的发酵培养条件为：25～35℃，180转/分震荡培养36～48小时后，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的芽孢形成率95％以上，收集芽孢。优选地，本发明一种防螨菌剂，还包括薄荷提取液。所述薄荷提取液的提取方法是：将薄荷叶洗净、晾干、研磨，按1:10比例加水，加热回流1小时提取，离心，取上清液，即为10％浓度的薄荷提取液。所述薄荷提取液的用量为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌总体积的1/10～1/4，优选为1/8。本发明进一步，提供所述防螨菌剂的应用，包括在制备除螨洗涤剂或除螨杀虫剂中的应用。本发明防螨菌剂用于洗涤剂领域，制备成防螨产品，如防螨衣物柔顺剂，除螨沐浴露、洗面奶等；本发明防螨菌剂用于杀虫剂领域，制备成除螨剂、除螨喷雾等；优选地，本发明提供一种防螨益生菌柔顺剂，包括如下重量份的原料：防螨菌剂16～32份(枯草芽孢杆菌8～16份、解淀粉芽孢杆菌4～8份、短小芽孢杆菌4～8份)；水50～75份；薄荷提取液1～3份；十二烷基葡萄糖苷10～15份；阳离子聚丙酰胺0.1～0.5份。所述防螨益生菌柔顺剂的使用方法：将织物按照正常流程进行清洗，洗涤最后阶段加入，按100kg织物加入本品650ml～800ml，也可视类别及实际要求而调整用量。使用温度：常温或40～50℃。螨虫有40余种，其中与人体健康有关的有十多种。最常见的有尘螨、粉螨、蠕螨、疥螨等。调查表明，成年人约有97％感染螨虫，其中以尘螨为主。尘螨的尸体、分泌物和排泄物都是可致病的过敏原。它们分布在地毯、沙发、毛绒玩具、被褥、坐垫、床垫和枕芯等处孳生，以人的汗液、分泌物、脱落的皮屑为食，繁殖速度极快。其次还有：粉螨，主要在贮存的食品和粮食中繁殖；蠕螨，主要寄生在人的毛囊和皮脂腺中，如鼻、耳、头皮、前胸、后背、耳道等地方；疥螨，寄生于人和哺乳动物的皮肤表层。此外，越来越多的家庭饲养宠物，极易导致疥螨通过衣裤、被褥直接传播给人，甚至造成人与人之间的相互传播。因此，在日常生活中防治尘螨、粉螨、蠕螨、疥螨等非常必要。本发明通过将几种芽孢杆菌复配得到效果显著的防螨菌剂，能够实现防螨抑螨且环境友好、对人体无任何不适。枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌是一种自然界中广泛存在的好氧革兰氏阳性菌，在生物防治应用中对多种致病微生物有明显抑制作用。其抑制机理是通过消耗游离氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其他致病菌生长；而且通过在生长代谢过程中产生抗菌蛋白或者多肽等活性物质，直接对多种病原细菌、真菌等起到抑制作用，形成以革兰氏阳性菌为主导的生长环境。经研究表明，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌抑菌活性高效、广谱，且无毒、无害。本发明在此基础上开发了防螨菌剂，进一步可将其制成防螨益生菌柔顺剂、防螨抑螨沐浴液、防螨除螨洗手液、除螨杀虫剂等，充分满足日常生活的需要。本发明防螨益生菌柔顺剂使用后织物中保留有芽孢杆菌，在使用后遇到皮肤分泌物、汗液及排泄到下水道中遇到多氮、多磷、多碳源等营养物时，能够萌发生长；同时皮肤分泌物、汗液及下水道中多氮、多磷、多碳源等营养物质做为培养基利用，从而将其分解代谢，达到除味、除臭及清洁环境的作用。同时代谢产生的抑菌物质能够有效的抑制或杀灭日常用品中的螨虫及致病菌及下水道中的致病菌，且环境友好。本发明能间接改良与之接触的皮肤表面上的微生物组成；清洗排放至下水道的含洗涤剂的自来水，能改善下水道的环境，具有去污除臭抑菌的效果。本发明防螨益生菌柔顺剂保质期为两年，在保质期内均具有杀螨作用。本发明具有如下优点：(1)本发明除螨效果显著。本发明对革螨、蠕形螨、疥螨、尘螨、粉螨等多种危害人体的螨虫具有很强的抑杀作用。同时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌均有杀灭作用。(2)本发明具有极高的安全性、无毒、无刺激。芽孢杆菌广泛存在于自然界中，本发明采用多种芽孢杆菌的生物制剂替代传统的化学试剂，对人体和环境都安全无害。(3)本发明对人有益，且环境友好。芽孢杆菌间接改良与之接触的皮肤表面上的微生物组成。使用本发明产品清洗衣物后排放至下水道后，能改善下水道的环境，具有去污除臭清洁的效果。(4)本发明产品适用范围广泛、操作便捷。本发明满足了日常生活中绝大多数抗菌防螨的需求。本发明的防螨益生菌柔顺剂能充分调理织物纤维，减少纤维黏结，令衣物顺滑柔软，手感舒适，不伤皮肤，用后芬芳怡人。(5)本发明制作简单，成本低，可广泛生产应用。具体实施方式下面结合实施例和试验对本发明的技术方案进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例1.一种防螨菌剂，制备步骤如下：步骤一、种子发酵液的制备，以500ml锥形装瓶配制100ml液体培养基i(酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨0.7～1％，氯化钠0.5～1.2％，葡萄糖0.5～2％，ph7.0～7.2)，在121℃，0.1mpa灭菌20分钟，冷却至室温。步骤二、将来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，菌种编号为1.1413的枯草芽孢杆菌，cgmcc编号为1.936的解淀粉芽孢杆菌和cgmcc编号为1.4442的短小芽孢杆菌分别接种于液体培养基i中，摇床培养15小时(30℃，180转/分)。步骤三、发酵培养基的制备，以500ml锥形装瓶配制150ml液体培养基ii(氯化钠0.5～1.2％，蛋白胨0.7～1％，酵母膏0.5～1.5％，葡萄糖1～1.5％，碳酸铵0.3～0.5％，水余量，ph7.0～7.2)，在121℃，0.1mpa灭菌15分钟，冷却至室温。步骤四、将摇床培养15小时的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的种子液按照体积比3％接种量分别接种于液体培养基ii中，摇床培养46小时(30℃，180转/分)。步骤五，将摇床培养46小时的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的发酵液取出，以5000转/分钟的转速离心15分钟，收集芽孢。枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的芽孢形成率95％以上。将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌按照菌体数量2:1:1混合即可。实施例2.一种防螨益生菌柔顺剂，包括如下重量份的原料：枯草芽孢杆菌16份；解淀粉芽孢杆菌8份；短小芽孢杆菌8份；去离子水55份；薄荷提取液3份；十二烷基葡萄糖苷12份；阳离子聚丙酰胺0.3份。首先按照实施例1方法培养获得枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。然后将阳离子聚丙酰胺用1％的水溶解并搅拌10min至均匀，得溶液a。向上述溶液a中加入十二烷基葡萄糖苷，并加入薄荷提取液，搅拌15min至均匀，制得溶液b。最后将培养收集的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌芽孢加入溶液b中，制得成品。其中所述薄荷提取液的提取方法是：将薄荷叶洗净、晾干、研磨，按1:10比例加水，加热回流1小时提取，离心，取上清液，即为10％浓度的薄荷提取液。实施例3.一种防螨益生菌柔顺剂，包括如下重量份的原料：枯草芽孢杆菌8份；解淀粉芽孢杆菌4份；短小芽孢杆菌4份；去离子水72份；薄荷提取液3份；十二烷基葡萄糖苷10份；阳离子聚丙酰胺0.1份。制备方法与实施例2相同。实施例4.一种除螨沐浴露，包括如下重量份原料：枯草芽孢杆菌16份；解淀粉芽孢杆菌8份；短小芽孢杆菌8份；去离子水40份；薄荷提取液3份；甘油10份；珠光浆6份；肉豆蔻酸钠9份；柠檬酸0.2份；氢氧化钠0.1份。将乳化锅进行高温高压消毒后，加入去离子水，升温至80℃，依次加入肉豆蔻酸钠、珠光浆、甘油、薄荷提取液、柠檬酸和氢氧化钠，低速搅拌10min至均匀，停止加热，中速搅拌30min，制得溶液a。最后将培养收集的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌芽孢加入溶液a中，制得除螨沐浴露。实施例5.一种除螨洗面奶，包括如下重量份原料：枯草芽孢杆菌16份；解淀粉芽孢杆菌8份；短小芽孢杆菌8份；去离子水45份；薄荷提取液3份；酰基磺酸钠10份；棕榈酸6份；月桂酸3份；增稠剂1份；氢氧化钠0.5份；柠檬酸0.2份。将去离子水加入反应皿中，加热至80℃，按照比例将薄荷提取液、棕榈酸、月桂酸和增稠剂混合，搅拌均匀，得到混合物a。再向混合物a中依次加入酰基磺酸钠、氢氧化钠和柠檬酸，搅拌均匀，制得混合物b，并停止加热。最后将培养收集的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌芽孢加入溶液b中，制得除螨洗面奶。试验例一、不同配比的三种芽孢杆菌的防螨效果研究本试验研究了不同配比的芽孢杆菌防螨效果，试验设计及结果如表1所示。试验方法与步骤：在有盖容器内部放入一块10mm×200mm的海绵。注入饱和氯化钠，并刚好没过海绵。在中心和四周放置培养皿，并固定在粘板上。于中心培养皿上放入200只活螨。按照表1配制不同比例的防螨菌剂，于外围培养皿中加入测试样品，盖上容器盖，24h后观察螨虫存活情况。试验重复三次，计算平均值。表1.不同菌体数量比配比的三种芽孢杆菌的防螨效果试验组abcdefghijkl枯草芽孢杆菌100055053.36128解淀粉芽孢杆菌01002.55503.32641短小芽孢杆菌00102.50553.32341活螨数目485559203853352522363833结论：根据试验结果可知，三种芽孢杆菌按照一定比例复配效果显著优于单一种类的芽孢杆菌的防螨效果。说明三者复配有协同的效果。枯草芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：短小芽孢杆菌为2:1:1或3:1:1或1:1:1时防螨效果显著优于其他配比。且当枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，三者按照2:1:1比例混合除螨效果最佳。试验例二、三种芽孢杆菌与薄荷提取液复配后防螨协同效果研究薄荷是我国常用的传统中药之一，也是一种中药的香料植物，其具有一定的抑菌作用，可作为天然抑菌剂。本试验研究了薄荷提取液与三种芽孢杆菌按照体积比不同配比的防螨效果，试验设计及结果见表2。其中，三种芽孢杆菌按照枯草芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：短小芽孢杆菌＝2:1:1(菌体数量比)配比。试验方法与步骤同试验例1。表2.三种芽孢杆菌与薄荷提取液按照不同体积比复配后防螨效果试验组abcdefg枯草芽孢杆菌16161616161616解淀粉芽孢杆菌8888888短小芽孢杆菌8888888薄荷提取液024681012活螨数目20131011121819结论：根据试验结果，可见薄荷提取液与三种芽孢杆菌复配后，与三种芽孢杆菌具有协同除螨功效、当薄荷提取液的用量为三种菌总体积量的1/10～1/4时除螨效果良好。且当枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌与薄荷提取液比例按照16:8:8:4比例(即薄荷提取液的用量为三种菌总体积量的1/8)混合除螨效果最佳。试验例三、本发明柔顺剂品质试验、与市售产品效果对比试验对比例1.一种防螨益生菌柔顺剂，包括如下重量份的原料：枯草芽孢杆菌16份；解淀粉芽孢杆菌8份；短小芽孢杆菌8份；水55份；薄荷提取液2份；十二烷基葡萄糖苷12份；二酰胺乙基烷氧基季铵化合物0.3份。制备方法与实施例2相同。与实施例2区别在于将阳离子聚丙酰胺替换为二酰胺乙基烷氧基季铵化合物。对比例2.一种防螨益生菌柔顺剂，包括如下重量份的原料：枯草芽孢杆菌16份；解淀粉芽孢杆菌8份；短小芽孢杆菌8份；水55份；薄荷提取液2份；壳聚糖12份；阳离子聚丙酰胺0.3份。制备方法与实施例2相同。与实施例2区别在于将十二烷基葡萄糖苷替换为壳聚糖。一、本发明柔顺剂杀螨防螨作用时效将实施例和对比例柔顺剂成品置于常温存放，过一段时间测定其中成分含量，结果见表3。表3.不同柔顺剂长期成分变化经试验验证，浓度为107cfu/ml时，杀螨效果最佳，抑螨率可达90％以上。当菌体浓度为105～106时，也有一定防螨功效，抑菌率约70％～83％。试验证实本发明产品在两年保质期内具有有效杀螨作用。同时对比例1和对比例2与实施例2相比，仅在于所采用的表面活性剂成分不同，通过结果比较可见，本发明所采用的表面活性剂较其他成分可以有效保证芽孢杆菌的菌体活性。二、对螨虫防效试验将实施例2的柔顺剂成品和市售除螨洗衣液应用于螨虫卵、幼虫和成虫进行试验，放置于密闭的玻璃罩中，每组200只。喷施后1、3、5、7天分别记录活螨数量，统计防治效果，结果见表4。表4.不同柔顺剂处理后螨虫卵、幼虫、成虫的活螨数量统计根据试验结果分析，本发明对螨虫具有良好的抑制效果，对螨虫进行喷雾处理后，在7天时对螨虫的防治效果均超过77％，其中对螨虫卵防治效果最好，达到90.5％。与市售除螨洗衣液相比较，本发明具有明显除螨优势。三、对织物柔顺性作用效果试验检测对象为实施例2-3制备的柔顺剂成品，和一种市售的柔顺剂。对上述测试对象处理后的织物进行弯曲柔软性检测，结果见表5。表5.不同柔顺剂处理后织物柔软性能弯曲长度越小，证明织物越柔软。根据试验结果分析，不同织物经实施例2-3的柔顺剂处理后，弯曲度与市售柔顺剂差距不大，说明本明产品具有良好的使织物柔顺的功效。四、对下水道去污除臭试验本试验以垃圾渗滤液中nh3和h2s的去除率为除臭标准，检测本发明柔顺剂成品对环境生物除臭效果，结果见表6。表6.不同柔顺剂处理后对nh3和h2s去除率根据试验结果分析，实施例2中柔顺剂的nh3和h2s去除率分别为67.28％和60.59％，除臭效果最佳，同时实施例3去除效果也较好。而市售除螨洗衣液或市售柔顺剂不具有去除nh3和h2s作用。试验验证本发明对下水道具有去污除臭效果。五、皮肤过敏试验本试验征集了3名无过敏源的志愿者进行样品皮肤过敏试验。先用蒸馏水或生理盐水浸湿一块纱布，拧至半干，将样品涂抹在纱布一面，然后敷在前臂伸侧或背部正常皮肤上，再盖上1.5cm2不透气的塑料薄膜，以胶布固定。经过24～48h查看，假如测试处出现剧烈痒或灼痛感，标明该样品对皮肤具有刺激性，呈现阳性反应，应及时将实验物去掉，用水冲洗。若无任何病症，则为阴性反应，标明该样品无刺激性。对各实例进行检测，结果见表7。表7.本发明各实例的皮肤过敏试验结果样品测试人数24h结果48h结果实施例23人阴性阴性实施例33人阴性阴性实施例43人阴性阴性实施例53人阴性阴性由表7可见，本发明对人体无任何刺激性，使用安全性良好。当前第1页12