一种胃癌靶向重组免疫毒素的快速纯化方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种胃癌靶向重组免疫毒素的纯化方法。

背景技术

胃癌是世界范围内发病率最高的癌症之一，也是中国的第二大常见肿瘤。手术是目前根治胃癌的唯一方法，对于中晚期患者除了进行手术治疗外，常配合化疗和放疗等治疗手段；但化疗和放疗的副作用太大，往往严重破坏病人的免疫系统，给病人造成极大痛苦。随着抗体疗法在靶向治疗中的大获成功，mooltenfl等提出了免疫毒素的概念，为癌症的治疗带来一片光明；免疫毒素是一类由靶向分子与毒素分子连接构成的嵌合蛋白，利用抗原-抗体、细胞因子-受体的特异性结合，并基于肿瘤细胞表面特殊标志物或受体与正常细胞间的巨大差异，特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无损害。近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因重组技术将导向的抗体片段或配体基因与毒素活性片段基因进行融合表达，纯化制备得到新型重组毒素。新型重组免疫毒素具有靶向性好、杀伤能力强、毒性低、免疫原性小以及能够大量生产等优点，具有良好的开发应用前景。

目前已有许多针对不同肿瘤靶向的重组免疫毒素进入临床试验阶段。美国已有一种该类药物(dab389il-2，ontak)上市，另有15种该类药物进入i期以上的临床试验，国内朱平教授领导的研究小组研制的lhrh-pe40重组免疫毒素也已进入ii期临床试验。在血液肿瘤方面，ontak可靶向杀伤il-2r阳性细胞，在对144例细胞淋巴瘤患者进行的iii期临床试验中，其中100例给予ontak的患者中10例完全缓解，34例部分缓解，总缓解率为44％；bl22(rfb4(dsfv)pe38)可靶向杀伤cd22阳性的淋巴瘤细胞，16例白血病患者中11例完全缓解，2例部分缓解，且完全缓解的患者中有6例在仅接受一个疗程的bl22后即达到完全缓解。anti-b4-br可靶向杀伤cd19阳性细胞，12例b细胞非霍奇金淋巴瘤患者中11例患者在接受anti-b4-br治疗后得到部分缓解；在实体瘤方面，ss1p[ss1(dsfv)-pe38]可以特异性杀伤间皮素高表达细胞，用于治疗间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌等间皮素高表达肿瘤患者，13例恶性间皮瘤患者在经过ss1p治疗后10例得到部分缓解；igf-i-pe40靶向癌细胞表面的胰岛素样生长因子(igf-i)，能杀伤乳腺癌细胞、肝癌细胞。

作为活性单元的毒素分子，最常用的为白喉毒素(diphtheriatoxin，dt)和绿脓杆菌外毒素(pseudomonasexotoxin，pe)。由于成人体内大都存在dt的抗体，因此其应用受到一定的限制。pe毒素的高毒性及细胞杀伤机制已得到详细阐述，是制备重组免疫毒素的一种理想毒素分子。pe毒素被细胞内化后发挥adp核糖基化活性使细胞内eef-2失活，通过阻碍蛋白质合成过程引起细胞凋亡，此外，pe毒素还可以通过其他途径诱导细胞凋亡。但由于天然的pe毒素分子量较大且细胞穿透力不足，其被修饰和改造出现了几种衍生物，最常用的结构有pe40kdel和pe38kdel，缺失ia区使其失去细胞结合能力的同时使用kdel序列替换redlk，增加其内质网亲和性。改良后的pe毒素分子量减小、细胞毒性和分子穿透力增加，并降低了其由于体内免疫学反应导致的副作用。此外，理论上一个重组毒素分子与肿瘤细胞结合后就可以将该细胞杀死，但由于毒素内化效率、胞内furin酶切割效率的影响，杀死一个肿瘤细胞需要400-1000个毒素分子。这就确保了少量非特异性结合至正常细胞表面的毒素不能发挥细胞毒作用，从而保证了药物的安全性，因此重组免疫毒素在治疗肿瘤方面具有很高的价值。

近年来，众多国内外学者开展了大量关于胃肠道肿瘤生长、侵袭、转移等发病机制及信号转导的研究。研究显示，胃肠道肿瘤细胞表面表达的胆囊收缩素受体(cholecystokininreceptor,cckr)可通过内分泌或旁分泌途径促进肿瘤的增生及转移。肿瘤细胞合成分泌胆囊收缩素(cho1ecystokinin,cck)和胃泌素(gastrin,gs)，同时表面表达cckr，cck和gs作为生长因子与周围细胞表面的cckr结合，产生增殖信号传入细胞核内，引起肿瘤细胞大增殖，尤其是2型胆囊收缩素受体(cck2r)在大多数胃癌、结直肠癌细胞及癌旁组织细胞膜上高表达，而正常组织表达量极低，说明其与胃癌的发生发展过程有密切关系，是胃癌诊断和治疗的理想靶点。

胃泌素(gastrin,gs)是一种通过cck2r调节胃酸分泌的激素。近年来的研究发现，胃泌素具有促进细胞增殖与分化，抑制肿瘤细胞凋亡及协同环氧化酶-2促癌作用。人体内具有生物活性的胃泌素绝大多数为酰胺化胃泌素(g17-nh2、g34-nh2)，其中占80％-90％的g17-nh2是胃窦胃泌素的主要形式，具有全面的生理学功能。成熟的g17-nh2序列与胆囊收缩素具有相同的c端酰胺化5肽结构。此外，通过人工合成胃泌素发现，仅需c端四肽就可以结合并活化cck2r，但是随着缩短成熟g17-nh2的n端的氨基酸残基，其活性及与肿瘤细胞的亲和力明显降低。因此，胃泌素也可以和cck2r结合从而引发一系列的生物学反应，但g17-nh2是制备免疫毒素时，确保活性及亲和力的最佳形式。

总之，cck2r作为重组毒素靶向细胞的结合单位，其在肿瘤细胞与正常细胞上表达数量的差别是其准确杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞的关键因素。而g17-nh2与cck2r的高效特异性结合，更是进一步提高了重组毒素的靶向杀伤作用。因此，宋杰,任洪林,李岩松等(rg17pe38,一种靶向高表达cck-2r胃癌的新型免疫毒素[j].靶向药物期刊,2013,21(4):375-382)构建了一株融合表达反向g17-nh2和pe38kdel毒素的大肠杆菌bl21(de3)plyss(pet-rg17-pe38kdel)。通过密码子优化以及诱导表达条件优化后，小体积诱导表达重组毒素60％以上为可溶状态。亲和层析后重组蛋白可特异性靶向杀伤cck2r高表达的肿瘤细胞。但为了更好的保持重组蛋白的杀伤活性，并满足实际应用时用量的需求，扩大化生产发酵及快速高效纯化显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明提供一种胃癌靶向重组免疫毒素的快速纯化方法，利用三步纯化法快速纯化一种原核表达的pe类重组免疫毒素。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：

(1)取iptg诱导后重组菌体，300w，30min超声破碎，离心取上清并加入终饱和度为40％的硫酸铵，充分混匀后离心收集沉淀；

(2)使用上样缓冲液重悬步骤(1)中的蛋白沉淀，并在相同缓冲液中透析3h；

(3)取透析后蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质(qsepharosefastflow)，后通过该纯化系统以0-1mol/l氯化钠缓冲液浓度梯度洗脱，收集0.2-0.9mol/l氯化钠浓度下洗脱的蛋白溶液；

(4)将收集的蛋白溶液再次经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质(g-25)除盐，其缓冲体系被置换为保存液，收集所有蛋白溶液；

(5)通过milipore10kd超滤管，低温离心上述收集蛋白溶液，收集滤液，经上述纯化过程后得到的胃癌靶向重组免疫毒素rg17pe38kdel的纯度可达95％以上。

本发明所述iptg诱导后重组菌体的制备步骤如下：

取甘油保存的已构建完成表达菌株bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)通过接种环于lb固体培养基(50mg/l抗生素)上划线接种活化，37℃培养过夜挑取单菌落接种于5ml液体lb培养基中，取过夜摇培的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌液以1％的接菌量接种到1llb液体培养基(kana+)中,180rpm/min,37℃摇培2h后加入0.5mm诱导剂iptg，180rpm/min16℃摇培16h，经sds-page电泳验证，所表达蛋白65％以上为可溶状态。

本发明所述步骤(1)离心条件是8000g，30min，4℃。

本发明所述步骤(2)中上样缓冲液为20mmtris-hcl，ph7.0。

本发明所述步骤(4)中保存液为50mmol/lna3po4,100mmol/lnacl,1mmol/ledta,ph7.4。

本发明所述步骤(5)中低温离心条件为5000g，30min，4℃。

本发明利用已构建并筛选的可高效表达可溶性rg17pe38kdel的重组大肠菌株，优化大体积培养条件，扩大培养诱导体积至1l，1％接种量接种于lb培养基中，37℃摇培2h后加入0.5mm诱导剂iptg，180rpm/min16℃摇培16h，所表达蛋白65％以上为可溶状态；通过超声破碎法获得可溶性蛋白后，通过三步层析方法得到较高纯度与活性的重组毒素rg17pe38kdel，获得可用于药物评价的具有良好活性的高纯度毒素，纯化过程后得到的胃癌靶向重组免疫毒素rg17pe38kdel的纯度可达95％以上，纯化后重组毒素rg17pe38kdel可以与肿瘤细胞表面cck2r结合，并杀伤该类靶向肿瘤细胞，rg17pe38kdel作为抗肿瘤药物的生产工艺放大及临床应用前研究。

附图说明

图1是大肠杆菌表达重组毒素的鉴定图，其中：

m:低分子量蛋白marker；

1：1mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-28a)空载体对照；

2：1mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)的结果；

图2是western-blot验证rg17pe38kdel重组蛋白的表达图，其中：

m:彩虹180光谱蛋白marker(11-180kd)；

1:未诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

2:1mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

图3是重组毒素放大体积诱导表达条件的优化图，其中：

m：低分子量蛋白marker；

1：5ml小体积诱导表达的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

2：1l大体积诱导表达的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

3：1l未诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

图4是放大诱导培养后重组毒素在细菌上清和包涵体中的分布图，其中：

m：低分子量蛋白marker；

1：未诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

2：经0.5mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液；

3：经0.5mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解液上清；

4：经0.5mmiptg诱导的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌体裂解包涵体；

图5是重组毒素rg17pe38kdel纯化效果图，其中：

1、对照，2、iptg诱导表达效果，3、40％硫酸铵沉淀效果，4、qsepharosefastflow纯化效果，5、分子筛超滤纯化效果；

图6是重组毒素rg17pe38kdel对bgc-823细胞的杀伤效果图，其中：

上图是空白对照图，下图是rg17pe38kdel作用48h的效果图；

图7是重组毒素rg17pe38kdel对hct-116细胞的杀伤效果图，其中：

上图是空白对照图，下图是rg17pe38kdel作用48h的效果图；

图8是受体cckbr免疫荧光检测结果图，其中：

(a)bgc-823+3b9(抗pe38抗体)+荧光二抗；(b)bgc-823+4c3(抗da抗体)+荧光二抗；(c)bgc-823+rg17pe38+3b9+荧光二抗。

具体实施方式

包括下列步骤：

(1)取iptg诱导后重组菌体，300w，30min超声破碎，离心取上清并加入终饱和度为40％的硫酸铵，充分混匀后离心收集沉淀；

(2)使用上样缓冲液重悬步骤(1)中的蛋白沉淀，并在相同缓冲液中透析3h；

(3)取透析后蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质(qsepharosefastflow)，后通过该纯化系统以0-1mol/l氯化钠缓冲液浓度梯度洗脱，收集0.2-0.9mol/l氯化钠浓度下洗脱的蛋白溶液；

(4)将收集的蛋白溶液再次经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质(g-25)除盐，其缓冲体系被置换为保存液，收集所有蛋白溶液；

(5)通过milipore10kd超滤管，低温离心上述收集蛋白溶液，收集滤液，经上述纯化过程后得到的胃癌靶向重组免疫毒素rg17pe38kdel的纯度可达95％以上。

本发明所述iptg诱导后重组菌体的制备步骤如下：

取甘油保存的已构建完成表达菌株bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)通过接种环于lb固体培养基(50mg/l抗生素)上划线接种活化，37℃培养过夜挑取单菌落接种于5ml液体lb培养基中，取过夜摇培的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌液以1％的接菌量接种到1llb液体培养基(kana+)中,180rpm/min,37℃摇培2h后加入0.5mm诱导剂iptg，180rpm/min16℃摇培16h，经sds-page电泳验证，所表达蛋白65％以上为可溶状态。

本发明所述步骤(1)离心条件是8000g，30min，4℃。

本发明所述步骤(2)中上样缓冲液为20mmtris-hcl，ph7.0。

本发明所述步骤(4)中保存液为50mmol/lna3po4,100mmol/lnacl,1mmol/ledta,ph7.4。

本发明所述步骤(5)中低温离心条件为5000g，30min，4℃。

下边结合具体实施例及附图对本发明做进一步说明。

实施例1表达rg17pe38kdel重组菌株的鉴定

(1)表达菌株bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)的活化：接种环挑取甘油保存菌液于固体lb(kana+)培养基上划线，37℃培养箱孵育过夜后挑取单菌落，接种于5ml液体lb(kana+)培养基中；

(2)重组毒素rg17pe38kdel的诱导表达：接种至液体培养基后37℃，180rpm/min摇培6h，待菌液od600＝0.4～0.6时，加入1mm的诱导剂iptg，37℃，180rpm/min继续摇培6h。不加诱导剂iptg、相同条件培养的菌液作为阴性对照。

(3)sds-page电泳验证诱导：分别取1ml菌液于收集菌体后加入5×sds-pageloadingbuffer，沸水浴10min，通过10％sds-page电泳验证表达(重组蛋白分子量43kda，见图1)。

实施例2重组蛋白的western-blot鉴定

配制10％的sds-page电泳凝胶，每孔加入10μl实施例1中制备的诱导后蛋白样本，进行sds-page电泳；电泳后依次通过转膜、封闭、孵一抗、孵二抗以及ecl显色，最终化学发光成像系统分析拍照(见图2)。

实施例3扩大培养表达条件优化，结果见图3

(1)诱导温度的优化

过夜摇培的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌液以1％的接菌量接种到1llb液体培养基(kana+)中，180rpm/min37℃培养至od600为0.4，接入终浓度为1.0mm的iptg，分别在16℃、20℃、35℃、30℃、37℃条件下180rpm继续培养6h。

(2)诱导时机的优化

过夜摇培的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌液以1％的接菌量接种到1llb液体培养基(kana+)中，180rpm/min37℃培养0.5h、1.0h、1.5h、2h、2.5h、3.0h，接入终浓度为1.0mm的iptg，37℃条件下180rpm继续培养6h。

(3)诱导剂用量的优化

过夜摇培的bl21(de3)plyss(pet-rg17pe38kdel)菌液以1％的接菌量接种到1llb液体培养基(kana+)中，37℃180rpm摇培至od600为0.4，分别加入不同终浓度的iptg：0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、5.0mm，37℃180rpm继续培养6h。

优化大体积培养条件，扩大培养诱导体积至1l，1％接种量接种于lb培养基中，37℃摇培2h后加入0.5mm诱导剂iptg。

实施例4蛋白纯化策略优化，结果见图5

(1)硫酸铵沉淀浓度优化

重组菌经iptg诱导后，300w30min超声破碎，8000rpm/min离心30min取上清；分为6等份的超声上清中分别加入终饱和度为10％、20％、30％、40％、50％、60％的硫酸铵，充分混匀后离心收集上清，继续加入硫酸铵至饱和度为20％、30％、40％、50％、60％和70％，离心弃上清；取沉淀制备加入5xloadingbuffer后煮样制备蛋白样本，进行12％sds-page分析。筛选最佳硫酸铵浓度；

(2)离子交换层析条件筛选

首先，用ph7.0的tris-hcl将步骤(1)中获得沉淀重悬，并用相同的缓冲液4℃透析3h，透析后蛋白溶液过滤进行离子交换层析。分别检测以下几种离子交换层析介质的纯化效果：qsepharosefastflow、deaesepharosefastflow、anxsepharose4fastflow(highsub)及qsepharosexl；收集各峰及洗脱液，并进行12％的sds-page电泳鉴定纯化效果，筛选最佳离子交换层析介质；

然后同样步骤进行ph7.0、ph7.2、ph7.4、ph7.6、ph7.8及ph8.0六个ph梯度下离子交换层析最佳ph值的筛选；

(3)超滤条件筛选

收集离子交换层析纯化后蛋白溶液，通过不同孔径超滤管分别超滤去除杂蛋白，同样进行12％的sds-page电泳鉴定分离效果。

实施例5细胞杀伤活性检测，结果见图6、图7

将生长状态良好的细胞(bgc-823和hct-116)经胰酶消化1min后，重悬制备单细胞细胞并计数，96孔细胞板中每孔加入约10³个细胞，4h后加入终浓度为2000ng/ml的rg17pe38kdel重组蛋白，37℃co2培养箱中继续培养，36h后观察细胞形态变化及死亡情况。

实施例6受体免疫荧光检测，结果见图8

生长状态良好的bgc-823细胞用胰酶消化后计数，铺入放有玻璃片的24孔板，10⁶个/孔。37℃培养过夜，加入4％的多聚甲醛固定30min；pbst(0.05％tween-20)洗涤4次，30min内完成；pbst+5％血清封闭30min；加入rg17pe38蛋白，孵育5min，pbst洗涤4次，加入3b9抗体室温孵育1h；pbst洗涤4次；加入荧光二抗dylight488，孵育30min；pbst洗涤4次；荧光显微镜观察结果。