一种益生菌转化制备阿拉伯木寡糖的方法与流程

本发明涉及饲料添加剂领域，具体涉及一种益生菌转化制备阿拉伯木寡糖的方法。

背景技术

阿拉伯木寡糖(arabinoxylo-oligosaccharides)由阿拉伯木聚糖降解获得，阿拉伯木聚糖的主链是由d-木糖为单体通过β-1，4糖苷键连接而成，在其c-(o)-2和c-(o)-3的位置上取代有α-阿拉伯糖。阿拉伯木寡糖由2-10个木糖(少数木糖支链连接阿拉伯糖)组成，有效成分是木二糖和木三糖。阿拉伯木寡糖与其他寡糖相比，其突出特点是热稳定性、酸稳定性和贮藏稳定性高。阿拉伯木寡糖因较难被人体消化酶系统分解直接进入大肠，一方面被肠道内的益生菌如双歧杆菌吸收代谢而大量增殖；另一方面微生物发酵产生的短链脂肪酸(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等)能降低肠道内的ph值，促进肠道功能、脂类代谢、钙和矿物质的吸收，因此阿拉伯木寡糖具有控制血糖水平、降血脂、抗过敏、降低胆固醇、抗氧化、免疫调节、抗感染等多种功能。阿拉伯木寡糖作为一种饲料添加剂，可以提高动物生产性能和饲料转化率，而且还能增强动物机体抵抗疾病免疫力，降低饲料中药物的用量，从而减少药物在动物体内的残留，提高产品品质，其在饲料工业及畜牧业中的应用已得到肯定。因此，阿拉伯木寡糖在医药、食品和动物饲料等方面具有巨大的应用价值。

阿拉伯木寡糖多通过降解阿拉伯木聚糖来源丰富的农林生物质原料来制备。阿拉伯木寡糖的制备原理是：选择富含阿拉伯木聚糖的木质纤维素原料，水解阿拉伯木聚糖主链上的糖苷键即可得到聚合度低的水解产物。在目前研究中，制备阿拉伯木聚糖的原料有蔗渣、玉米芯、阔叶木、玉米杆、亚麻纤维、麦秆、杏仁壳、啤酒糟的竹子等。阿拉伯木寡糖常用的制备方法有热水抽提法(包括蒸汽爆破)、酶水解法、酸水解法、碱水解法和微波降解法等。(1)热水抽提法是直接以水或者水蒸气作用于原料，是目前阿拉伯木寡糖生产中常用的一种方法。在高温高压的条件下，水中的水合氢离子与阿拉伯木聚糖上脱落的乙酰基生成的乙酸，在酸性条件下阿拉伯木聚糖的糖苷键断裂，从而阿拉伯木聚糖的聚合度降低，目标产物则溶解在水溶液中，而其它少部分纤维素或木质素则沉淀下来，然后对水溶液进行分离纯化，得到纯度较高的阿拉伯木寡糖。其中包含着大部分聚合度较高的阿拉伯木寡糖(分子质量为1000-2000g/mol)，也含有小部分分子量＜300g/mol聚合度较低的阿拉伯木寡糖。(2)酸水解法为阿拉伯木聚糖原料在酸性条件(如硫酸、盐酸、甲酸、三氟乙酸和硝酸等)下水解成聚合度较低的阿拉伯木寡糖。酸水解方法虽然简单、得率高，但是酸水解反应中会产生大量的游离单糖和单糖的降解产物，如戊糖可以产生糠醛，并进一步降解产生甲酸、乙酰丙酸等副产物，因此，在酸水解反应中，酸的种类、反应温度、ph和反应时间等因素都需要反复进行验证。(3)酶水解法对原料进行预处理后，以微生物产生的内切型木聚糖酶进行酶解，经分离提纯得到阿拉伯木寡糖。自然界中很多霉菌和细菌都产木聚糖酶。值得注意的是，微生物在产生β-1,4木聚糖酶的同时也产生β-木糖苷酶。木二糖在以上两种酶的作用下生成木糖。因此，筛选出能够产生高活性木聚糖酶和低活性木糖苷酶的微生物菌种便成为阿拉伯木寡糖生产的关键。酶水解法是用专一性的木聚糖酶对阿拉伯木聚糖进行降解进而得到分子量较低的阿拉伯木寡糖。酶水解法因条件温和、分子量分布相对容易控制且不会导致还原端基的氧化和降解，对环境的污染较小，是一种公认的比较理想的绿色制备方法。虽然酶水解法在阿拉伯木寡糖的制备中具有很多优势，但生产过程中要用到专一性内切木聚糖酶，成为限制降低阿拉伯木寡糖生产成本的关键因素。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。近年来有学者报道，将解淀粉芽孢杆菌作为益生菌应用在水产养殖、妊娠及产后哺乳期母猪以及肉鸡等动物日粮中，不仅增加饲粮中粗蛋白质、粗脂肪及淀粉的消化率，提高动物生长性能，还能降低致病菌的数量。除此之外，解淀粉芽孢杆菌能分泌广谱的糖苷水解酶，能够作为淀粉酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶的生产菌株。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种益生菌转化制备阿拉伯木寡糖的方法。

本发明提供了一种阿拉伯木寡糖的制备方法，是采用解淀粉芽胞杆菌将阿拉伯木聚糖转化为阿拉伯木寡糖。

所述方法包括如下步骤：将解淀粉芽胞杆菌接种于含有阿拉伯木聚糖的培养基中进行培养，得到阿拉伯木寡糖。

所述培养时间为12-36h。

所述培养基的ph为5.0-11.0。

所述培养温度为27-37℃。

所述培养时间具体为36h。

所述培养基的ph具体为7.0。

所述培养温度具体为37℃。

所述含有阿拉伯木聚糖的培养基具体可为含有所述阿拉伯木聚糖的0.2m磷酸钠缓冲溶液。所述阿拉伯木聚糖在所述培养基中的质量百分比具体可为1％。

将解淀粉芽胞杆菌接种于含有阿拉伯木聚糖的培养基后，培养体系中的初始菌浓度为1.0×10⁹cfu/ml～9.0×10⁹cfu/ml。

将解淀粉芽胞杆菌接种于含有阿拉伯木聚糖的培养基后，培养体系中的初始菌浓度具体可为5.0×10⁹cfu/ml。

培养结束后，将培养体系离心，上清液经阴离子树脂(dowex1×8100-200)和阳离子树脂(dowex50w×8100-200)吸附处理后，得到阿拉伯木寡糖。

所述阿拉伯木聚糖的制备方法包括如下步骤：

(1)将燕麦壳粉碎后加水煮沸得到浆液；

(2)取步骤(1)得到的浆液，依次采用α-淀粉酶和碱性蛋白酶进行酶解，得到原料；

(3)完成步骤(2)后，使用碱性溶剂对原料进行提取得到阿拉伯木聚糖。

本发明还保护一种制备阿拉伯木聚糖的方法：包括如下步骤：

(1)将燕麦壳粉碎后煮沸得到浆液；

(2)取步骤(1)得到的浆液，依次采用α-淀粉酶和碱性蛋白酶进行酶解，除去淀粉和蛋白质；

(3)完成步骤(2)后，使用碱性溶剂提取得到阿拉伯木聚糖。

以上任一所述步骤(1)中，燕麦壳粉碎后颗粒大小在0.5mm-2mm之间。

以上任一所述步骤(1)中，燕麦壳与水的配比为料液比1:12。

以上任一所述步骤(1)中，所述煮沸时间为30min。

以上任一所述步骤(2)加入α-淀粉酶前，首先将浆液ph调节至5.2-6.0(具体可采用1mol/l盐酸水溶液进行调节)，温度80-90℃之间。

以上任一所述步骤(2)中，加入α-淀粉酶后反应90min，然后常温冷却至45℃，再加入碱性蛋白酶磁力搅拌水解120min。

以上任一所述步骤(2)中，依次采用α-淀粉酶和碱性蛋白酶进行酶解后，用四层纱布过滤，弃去滤液，将沉淀洗涤(具体可将沉淀加200ml95％的乙醇或丙酮重悬，真空抽滤装置进行抽滤)后60℃真空干燥10h，得到原料。

所述燕麦壳与α-淀粉酶的配比关系为50g：40000u。

所述燕麦壳与碱性蛋白酶的配比关系为50g：400000u。

所述α-淀粉酶的酶活定义：1ml液体酶，于70℃、ph6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以“u/ml”表示。

所述碱性蛋白酶的酶活定义：1g固体酶粉，在40℃±0.2℃、ph10.5条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，为1个酶活力单位，以u/g表示。

以上任一所述步骤(3)中，所述碱性溶剂为5％(质量百分含量)naoh水溶液。

以上任一所述步骤(3)中，将原料加至5％(质量百分含量)naoh水溶液中，恒温搅拌1h进行提取，然后用4层纱布趁热过滤，收取滤液，向滤液中加入95％(体积百分含量)乙醇水溶液抽滤，收取沉淀，然后用70％(体积百分含量)乙醇水溶液抽滤洗涤沉淀3次，真空干燥，得到阿拉伯木聚糖。

所述原料与5％(质量百分含量)naoh水溶液的配比关系为5g：50ml。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的阿拉伯木寡糖。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的阿拉伯木聚糖。

本发明还保护阿拉伯木聚糖在制备阿拉伯木寡糖中的应用。

本发明还保护解淀粉芽胞杆菌在制备阿拉伯木寡糖中的应用。

以上任一所述解淀粉芽胞杆菌具体可为中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，菌种编号为cgmcc1.10901的解淀粉芽胞杆菌。

本发明提供一种益生菌转化法生产阿拉伯木寡糖的方法。主要有以下优点：1)不使用大量的酸，无污染环境的问题；2)无需制备廉价、高效、专一性木聚糖酶；3)本发明使用的益生菌为解淀粉芽孢杆菌，其在只含有阿拉伯木聚糖，不含有其它营养物质的培养基中生长，分泌木聚糖酶，产生阿拉伯木寡糖的易于分离，能够简化生产工艺，降低成本。

附图说明

图1为阿拉伯木聚糖酸解样品薄层层析测定结果。

图2为离子色谱检测阿拉伯木聚糖酸解产生的单糖图谱。

图3为不同培养时间对阿拉伯木寡糖产量的影响。

图4为不同ph对不同阿拉伯木寡糖产量的影响。

图5为不同培养温度对阿拉伯木寡糖的影响。

图6阿拉伯木寡糖和不同分子量葡聚糖分子量的检测图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

燕麦壳：鹤壁大用牧业有限公司，河南鹤壁。

α-淀粉酶：40000u/ml，山东隆科特酶制剂有限公司(酶活定义：1ml液体酶，于70℃、ph6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以“u/ml”表示)。

碱性蛋白酶：200000u/g，山东隆科特酶制剂有限公司(酶活定义：1g固体酶粉，在40℃±0.2℃、ph10.5条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，为1个酶活力单位，以u/g表示)。

木糖标准品：东京化成工业有限股份公司，1mg/ml。

阿拉伯糖标准品：东京化成工业有限股份公司，1mg/ml。

木二糖标准品：东京化成工业株式会社，1mg/ml。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，菌种编号为cgmcc1.10901。

实施例1、燕麦壳生产阿拉伯木聚糖

1、取燕麦壳50g粉碎(粉碎后颗粒大小在0.5mm-2mm之间)，按照料液比1:12，加入1l烧杯中，开水煮沸30min，并不断搅拌，得到浆液。

2、取步骤1得到的浆液，利用1mol/l盐酸水溶液调节ph至5.2-6.0，控制温度在80-90℃之间，加入α-淀粉酶1ml，不断搅拌，反应90min，然后常温冷却至45℃。

3、向步骤2的溶液中加入碱性蛋白酶2g，磁力搅拌水解120min，用四层纱布过滤，弃去滤液。利用95％的乙醇、丙酮抽滤洗涤沉淀多次(沉淀加200ml95％的乙醇或丙酮重悬，真空抽滤装置进行抽滤)。在60℃下，真空干燥10h，得到去除淀粉和蛋白质的原料。

4、将骤3得到的5g原料放入锥形瓶中，加入50ml5％(质量百分含量)naoh水溶液，在磁力搅拌器上恒温1h，用4层纱布趁热过滤，收取滤液，向滤液中加入95％(体积百分含量)乙醇水溶液抽滤，收取沉淀，然后用70％(体积百分含量)乙醇水溶液抽滤洗涤沉淀3次，真空干燥，得到阿拉伯木聚糖。

5、分析步骤4得到的阿拉伯木聚糖的组成，具体如下：

(1)酸解

称取50mg阿拉伯木聚糖，加入0.6ml72％浓硫酸，研磨2小时，加入50ml水后，转移至250ml三角瓶中(注意：需将全部糖液转移至三角瓶中，避免损失)，沸水浴3小时，加固体碳酸钡(3g)中和，抽滤，沉淀洗涤三次，滤液(包括沉淀洗涤液)约200ml浓缩定容至1ml，得到待测样品液。

(2)薄层层析分析

将待测液分别点于薄层层析板上，放入展开槽中展开，取出风干后，浸泡于显色剂中10s，在110℃显色3min，取出冷却到室温。

展开剂：正丁醇：乙酸：水＝2:1:1(体积比)，配置100ml，经两次展开；

显色剂：95％硫酸：乙醇＝1:1(体积比)，配置50ml；

点样量：2.5μl。

结果如图1所示。图1中，泳道1为阿拉伯木聚糖酸解前样品，泳道2为阿拉伯木聚糖酸解后样品，泳道3为木糖标准品，泳道4为阿拉伯糖标准品。

由图1可以得出，阿拉伯木聚糖的单糖成分是木糖和阿拉伯糖。

(3)离子色谱分析

色谱柱：dionexcarbopacpa200分析柱(3mm×250mm)与dionexcarbopacpa200保护柱(3mm×50mm)，脉冲安培检测器，柱温:30℃，洗脱液：(a)100mmnaoh；(b)100mmnaoh/1m醋酸钠，洗脱程序：92:8(％a:b)等速洗脱5min，92:8(％a:b)-50:50(％a:b)5-15min线性洗脱，50:50(％a:b)等速洗脱4min，流速为0.5ml/min，进样量为5μl。

结果如图2所示。经过计算木糖：阿拉伯糖(质量比)是10：1。

实施例2、利用解淀粉芽孢杆菌转化阿拉伯木聚糖生产阿拉伯木寡糖

一、菌株准备

(1)解淀粉芽胞杆菌的活化：将解淀粉芽胞杆菌划线于lb固体培养基中。挑取单菌落，接种于lb液体培养基中，37℃、200rpm培养24h。

(2)种子液的制备：将上述培养24h的解淀粉芽孢杆菌菌悬液以1％接种量接种于lb液体培养基中37℃、200rpm培养24h。

二、不同培养时间对阿拉伯木寡糖产量的影响

阿拉伯木聚糖糖液：称取1g实施例1中制备的阿拉伯木聚糖，溶于100mlph7.0的0.2m磷酸钠缓冲溶液中，置于加热磁力搅拌器上，加热搅拌至沸腾，115℃，30min高压灭菌后备用。

将步骤一制备的解淀粉芽孢杆菌菌悬液以1％接种量接种于阿拉伯木聚糖糖液中(体系初始菌浓度为5.0×10⁹cfu/ml)，37℃、200rpm培养不同时间取发酵液，利用薄层层析方法检测不同培养时间阿拉伯木寡糖的产量。具体如下：

发酵液12000rpm离心3min，上清液经阴离子树脂(dowex1×8100-200)和阳离子树脂(dowex50w×8100-200)吸附处理后，将样品液分别点于薄层层析板上，放入展开槽中展开，取出风干后，浸泡于显色剂中10s，在110℃显色3min，取出冷却到室温。

展开剂：正丁醇：乙酸：水＝2:1:1，配置100ml，经两次展开；

显色剂：900mg苔黑酚，25ml水，375ml无水乙醇，50ml浓硫酸。

点样量：1μl。

结果如图3所示。泳道1为木糖标准品，泳道2为阿拉伯糖标准品，3泳道2为木二糖标准品，泳道4为培养0h的发酵液样品，泳道5为培养3h的发酵液样品，泳道6为培养6h的发酵液样品，泳道7为培养9h的发酵液样品，泳道8为培养12h的发酵液样品，泳道9为培养24h的发酵液样品，泳道10为培养36h的发酵液样品，泳道11为培养48h的发酵液样品，泳道12为培养60h的发酵液样品，泳道13为培养72h的发酵液样品。

结果表明，在上述培养条件下，培养12h培养上清液就出现了阿拉伯木寡糖，随着培养时间的延长，阿拉伯木寡糖的产量逐渐升高，直到36h时阿拉伯木寡糖产量达到峰值。继续培养阿拉伯木寡糖的产量变化不大。

三、不同ph值对阿拉伯木寡糖产量的影响

配制不同ph值的阿拉伯木聚糖糖液：分别配制ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0和ph7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，ph8.0、ph9.0的tris-盐酸缓冲液，ph10.0、ph11.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，过滤除菌。

称取2g阿拉伯木聚糖溶于100ml蒸馏水中，置于加热磁力搅拌器上，加热搅拌至沸腾，制成2％的阿拉伯木聚糖溶液，115℃，30min高压灭菌后备用)中。将上述不同ph的缓冲液与2％的阿拉伯木聚糖溶液在超净台中等体积混合，制成不同ph值的1％阿拉伯木聚糖糖液。

将步骤一制备的解淀粉芽孢杆菌菌悬液以1％接种量分别接种于上述不同ph值的1％阿拉伯木聚糖糖液(体系初始菌浓度为5.0×10⁹cfu/ml)，37℃、200rpm培养36h取发酵液，利用薄层层析方法检测不同培养时间阿拉伯木寡糖的产量(具体同步骤二)。

结果如图4所示。泳道1为ph3.0，泳道2为ph4.0，泳道3为ph5.0，泳道4为ph6.0，泳道5为ph7.0，泳道6为ph8.0，泳道7为ph9.0，泳道8为ph10.0，泳道9为ph11.0。

结果表明，解淀粉芽孢杆菌不耐酸，在酸性条件下不生长，不分泌木聚糖酶，ph3.0和ph4.0的条件下没有阿拉伯木寡糖的产生。在ph5.0-11.0条件下，培养时间36h后发现有阿拉伯木寡糖的产生，阿拉伯木寡糖的产量差别不大。在ph7.0，培养36h后阿拉伯木寡糖产量最高。

四、不同温度对阿拉伯木寡糖产量的影响

阿拉伯木聚糖糖液：称取1g实施例1中制备的阿拉伯木聚糖，溶于100mlph7.0的0.2m磷酸钠缓冲溶液中，置于加热磁力搅拌器上，加热搅拌至沸腾，115℃，30min高压灭菌后备用。

将步骤一制备的解淀粉芽孢杆菌菌悬液以1％接种量接种于阿拉伯木聚糖糖液中(体系初始菌浓度为5.0×10⁹cfu/ml)，不同温度下200rpm培养不同时间取发酵液，利用薄层层析方法检测不同培养时间阿拉伯木寡糖的产量(具体同步骤二)。

结果如图5所示。泳道1为27℃培养50h，泳道2为27℃培养60h，泳道3为32℃培养50h，泳道4为32℃培养60h，泳道5为37℃培养50h，泳道6为37℃培养60h。结果表明，随着培养温度的上升，阿拉伯木寡糖的产量也随之升高。培养温度在37℃时，阿拉伯木寡糖的产量最高。

实施例3、阿拉伯木寡糖聚合度及成分分析

阿拉伯木聚糖糖液：称取1g实施例1中制备的阿拉伯木聚糖，溶于100mlph7.0的0.2m磷酸钠缓冲溶液中，置于加热磁力搅拌器上，加热搅拌至沸腾，115℃，30min高压灭菌后备用。

将实施例2步骤一制备的解淀粉芽孢杆菌菌悬液接种于以1％接种量接种于阿拉伯木聚糖糖液中(体系初始菌浓度为5.0×10⁹cfu/ml)，37℃、200rpm培养36h取发酵液，发酵液12000rpm离心3min，上清液经阴离子树脂(dowex1×8100-200)和阳离子树脂(dowex50w×8100-200)吸附处理后，使用凝胶渗透色谱进行分子量的测定。

色谱柱，tskgelgmpwxl(tosohbiosciencellc)串联tskgelg2500pwxl(tosohbiosciencellc)；流动相：去离子水。流速：1ml/min；检测时间，25min；上样量，20μl；检测器，蒸发光散射检测器。

结果如图6和表1所示。图6是阿拉伯木寡糖和不同分子量葡聚糖分子量的检测图谱。根据不同分子量对应的出峰时间绘制的标准曲线，计算得到样品中不同分子量寡糖的比例，见表1。聚合度在2-4的阿拉伯木寡糖(木二糖、木三糖和木四糖)占阿拉伯木寡糖总量的85％。

表1不同分子量阿拉伯木寡糖的组成和比例