一种蛹虫草发酵大豆肽及其制作方法与流程

本发明属于大豆肽制备技术领域，具体涉及一种蛹虫草发酵大豆肽及其制作方法。

背景技术

蛹虫草(cordycepsmilitaris(l.ex.fr)link)别名北冬虫夏草、蛹草、北虫草等。是一种药用和食用菌，与冬虫夏草是同一种属，蛹虫草的药用成分与冬虫夏草近乎相同，能够起到调节免疫、降低衰老速度、抗肿瘤等作用。蛹虫草富含虫草素、虫草酸、虫草糖等重要的活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗辐射以及调节免疫功能等众多功能，其中虫草素是蛹虫草的次生代谢产物中第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，在医药领域具有重要的药用价值和多种生理活性。由于天然的冬虫夏草资源数量非常少见，所以人工培育的蛹虫草菌体在医药，食品，保健等相关食药品领域已成为冬虫夏草的代替品。

大豆是人们十分喜爱的食品之一，具有丰富的蛋白质和其他活性成分，大豆肽(soybeanpeptides,sp)是以大豆蛋白为原料经水解、酶解、酸解等操作产生的由3-10个氨基酸组成，相对分子质量低于1000da的低肽类混合物，并且含有少量游离氨基酸，糖类，水分等，其营养成分与生理特性比大豆蛋白更胜一筹。酶解是食品工业生产大豆肽的最常见技术，而在大豆肽的工业化生产中，由于生产成本及分离技术的限制。大豆肽一般由相对分子质量在几百至几万的低肽与多肽组成，2008年颁布的国家大豆肽行业标准中，把以大豆蛋白为原料，经酶解及微生物发酵生成的相对分子质量在5000da以下的成分称为大豆肽。大豆肽具有抗高血压、降胆固醇、降低血糖、促进能量代谢及减肥效果。

虽然现有技术中已经存在较多的微生物转化技术，但是目前尚未发现利用蛹虫草发酵制备大豆肽的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种蛹虫草发酵大豆肽及其制作方法，开发了一种最佳的利用蛹虫草发酵制备大豆肽的方法，填补了蛹虫草发酵制备大豆肽的空白。

本发明提供的一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，包括以下步骤：

s1，将蛹虫草菌种进行活化，得到活化菌种；

s2，将s1得到的活化菌种接种到液体培养基中，摇床培养，得到蛹虫草种子液；

s3，接种：将大豆浸泡并灭菌，得到灭菌大豆，将s2所得蛹虫草种子液接入灭菌大豆中，接种后放入22℃环境中培养，发酵12～13天，停止培养，获得发酵大豆；

s4，发酵大豆肽的制作：将发酵大豆灭菌后干燥，经超微粉碎后得到发酵大豆肽。

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s1中培养时间为7～10d

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s2中，所述摇床培养的条件为22℃、150r/min，培养4～5天。

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，所述干大豆浸泡的具体步骤如下：将大豆放入容器中，加适量自来水使大豆完全浸入水中，于20℃浸泡8h，沥干后得到浸泡大豆。

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，大豆浸泡后灭菌的具体步骤如下：以每瓶30g的量将浸泡大豆分装至250ml发酵瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却，得到灭菌大豆。

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s4的具体步骤为：发酵大豆灭菌的条件为121℃灭菌30min。

优选的，上述蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s4的具体步骤为：发酵大豆干燥的条件为-20℃冷冻干燥10h，超微粉碎后过60目筛，得到发酵大豆肽。

本发明还提供了一种由上述任一方法制作而成的发酵大豆肽。

与现有技术相比，本发明提供的蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，具有以下

有益效果：

本发明确定了蛹虫草固体发酵大豆的发酵条件为22℃、10ml/100g灭菌大豆的接种量和12～13天的发酵周期。同时通过测量大豆肽的分子量、表观粘度、溶解度、乳化性质和乳化稳定性等理化性质，分析了大豆肽的相关特性。主要结论如下：

(1)经由sds-page电泳实验得出，发酵大豆肽的分子量很小，出现25kda以下小肽。

(2)发酵大豆肽的表现粘度低，发酵大豆肽的表现粘度并不随着浓度的增高的大幅变化，并且具有良好的流动性。

(3)发酵大豆肽拥有优良的溶解性，ph的变化对其影响很小，在任何ph范围内都有非常好的溶解性。

(4)发酵大豆肽具备一定的乳化性和乳化稳定性，与大豆分离蛋白相比，其乳化性及乳化稳定性随浓度的增长而增加。

(5)发酵大豆肽的氨基成分与未发酵的大豆蛋白近乎一致，与未发酵的大豆蛋白相比，大豆肽的物理特性更为明显，这为大豆肽功能性食品行业的发展奠定了良好的基础。大豆肽制备已经被大豆蛋白研究领域重点关注，开发肽类产品具有广袤的应用前景和不容小觑的市场潜力。

附图说明

图1为活化的蛹虫草菌种图片；

图2为液体培养基上出现白色菌丝球的图片；

图3为大豆表面长满白色菌丝的图片；

图4为实施例1及对比例1～2的小肽含量测定结果；

图5为实施例1及对比例3～4的小肽含量测定结果；

图6为实施例1及对比例5～6的小肽含量测定结果；

图7为不同样品的sds-page电泳结果；

其中，泳道m为蛋白maker；泳道1为对照未发酵的大豆蛋白液；泳道2为对比例7制作的蛹虫草发酵大豆肽；泳道3～4为对比例5制作的蛹虫草发酵大豆肽；泳道5～6为对比例6制作的蛹虫草发酵大豆肽；泳道7～8为实施例1制作的蛹虫草发酵大豆肽；

图8为实施例1发酵大豆肽和未发酵的大豆蛋白的表观粘度的测定结果。

具体实施方式

下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

本发明提供了一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，包括以下步骤：

s1，将蛹虫草菌种进行活化，得到活化菌种；

s2，将s1得到的活化菌种接种到液体培养基中，摇床培养，得到蛹虫草种子液；

s3，接种：将大豆浸泡并灭菌，得到灭菌大豆，将s2所得蛹虫草种子液接入灭菌大豆中，接种后放入22℃环境中培养，发酵12～13天，停止培养，获得发酵大豆；

s4，发酵大豆肽的制作：将发酵大豆灭菌后冷冻干燥，经超微粉碎后，过60目筛子，得到发酵大豆肽。

优选的，本发明一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，包括以下实施例。

下述实施例中采用的蛹虫草菌种为太空诱变高效蛹虫草菌(cordycepsmilitaris)s7-t9，保藏编号为cgmccno.4879(参考专利cn103262797b)，购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所用大豆为东北大豆，购于农贸市场；其基本成分如下：蛋白含量为45.82％，水分8.43％，脂肪1.52％，灰分6.41％。所用试剂和仪器均为市售。

所用sday斜面培养基制备如下：酵母浸出粉10g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，溶解于1000ml的水中，调节ph为6.2～6.4，121℃灭菌20分钟后恒温22℃培养24h，检菌后备用。

所用sday液体培养基制备如下：酵母浸出粉10g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，溶解于1000ml的水中，调节ph为6.2～6.4，121℃灭菌20分钟后备用。

实施例1

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，包括以下步骤：

s1，将蛹虫草菌种进行活化，得到活化菌种；

具体步骤如下：将蛹虫草菌接种于sday斜面培养基上，放入恒温培养箱中，培养温度设置为22℃，培养7d，待斜面上长满白色菌丝，斜面背部出现黄色基内菌丝即为成熟，得到活化菌种。活化的蛹虫草菌种图片如图1所示。

s2，制备种子液：将s1得到的活化菌种接种到装有100mlsday液体培养基的250ml三角瓶中，活化菌种的用量是1cm³左右大小的菌块2块，22℃、150r/min摇床培养4天，液体培养基上有白色菌丝球出现，得到蛹虫草种子液；图2是液体培养基上出现白色菌丝球的图片。

s3，接种：将大豆浸泡并灭菌，得到灭菌大豆，将s2所得蛹虫草种子液接入灭菌大豆中，接种量为10ml/100g灭菌大豆，接种后放入22℃避光培养13天(大豆表面长满白色菌丝)，停止培养，获得发酵大豆；图3是大豆表面长满白色菌丝的图片；

其中，大豆浸泡的具体步骤如下：将大豆放入容器中，加适量自来水使大豆完全浸入水中，于20℃浸泡8h，沥干后得到浸泡大豆；

大豆浸泡后灭菌的具体步骤如下：以每瓶30g的量将浸泡大豆分装至250ml发酵瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却，得到灭菌大豆。

s4，发酵大豆肽的制作：将发酵大豆121℃灭菌30min后，置于-20冷冻干燥10h，经超微粉碎后过60目筛得到发酵大豆肽。

实施例2

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，包括以下步骤：

s1，将蛹虫草菌种进行活化，得到活化菌种；

具体步骤如下：将蛹虫草菌接种于sday斜面培养基上，放入恒温培养箱中，培养温度设置为22℃，培养10d，待斜面上长满白色菌丝，斜面背部出现黄色基内菌丝即为成熟，得到活化菌种。

s2，制备种子液：将s1得到的活化菌种接种到装有100mlsday液体培养基的250ml三角瓶中，活化菌种的用量是1cm³左右大小的菌块3块，22℃、150r/min摇床培养5天，液体培养基上有白色菌丝球出现，得到蛹虫草种子液。

s3，接种：将大豆浸泡并灭菌，得到灭菌大豆，将s2所得蛹虫草种子液接入灭菌大豆中，接种量为10ml/100g灭菌大豆，接种后放入22℃避光培养12天(大豆表面长满白色菌丝)，停止培养，获得发酵大豆；

其中，大豆浸泡的具体步骤如下：将大豆放入容器中，加适量自来水使大豆完全浸入水中，于20℃浸泡8h，沥干后得到浸泡大豆；

大豆浸泡后灭菌的具体步骤如下：以每瓶30g的量将浸泡大豆分装至250ml发酵瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却，得到灭菌大豆。

s4，发酵大豆肽的制作：将发酵大豆经121℃灭菌30min后，再在-20冷冻干燥10h，经超微粉碎后过60目筛得到发酵大豆肽。

为了验证本发明的效果，我们进行了对比实验，并测定了其相关指标和活性物质含量。

对比例1

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，将s3中接种后避光培养的温度改为20℃，其余操作同实施例1。

对比例2

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，将s3中接种后避光培养的温度改为24℃，其余操作同实施例1。

对比例3

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，接种量改为5ml/100g灭菌大豆，其余操作同实施例1。

对比例4

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，接种量改为7ml/100g灭菌大豆，其余操作同实施例1。

对比例5

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，接种后避光培养的时间改为9天，其余操作同实施例1。

对比例6

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，接种后避光培养的时间改为11天，其余操作同实施例1。

对比例7

一种蛹虫草发酵大豆肽的制作方法，s3中，接种后避光培养的时间改为5天，其余操作同实施例1。

1、小肽含量的测定

(1)测定方法：称取发酵大豆肽10.0g，加入体积分数15％三氯乙酸溶液60ml充分溶解并定容至100ml。以10000r/min的速度离心20min，用移液枪吸取上清液10ml，放入凯斯烧瓶中，使用凯氏定氮法测定酸溶蛋白含氮量；取0.5g大豆放入干燥的凯斯烧瓶中进行上述的操作，测定大豆的含氮量。

含氮量％＝(v1-v2)×c×0.014×(1000/v3)

其中，v1：样品滴定消耗盐酸标准溶液体积(ml)；

v2：空白滴定消耗盐酸标准溶液体积(ml)；

v3：样品体积(ml)；

c：盐酸标准滴定溶液浓度(mol/l)；

小肽含量(％)＝(酸溶蛋白的含氮量÷大豆的含氮量)×100

(2)测定结果如下：

实施例1及对比例1～2的小肽含量测定结果如图4所示，可以看出在20～22℃发酵时小肽含量呈现上升趋势，在22℃以后发酵菌质中小肽的含量有所下降，小肽含量在22℃时达到11.16％。从图4中分析初步得出结论：在以小肽含量为指标的情况下，实施例1的22℃为最佳发酵温度。

实施例1及对比例3～4的小肽含量测定结果如图5所示，从图5中可以看出接种量在5～10ml/100g时，小肽含量逐步上升，接种量10ml/100g时小肽含量达到11.16％。所以蛹虫草固态发酵大豆在发酵温度为22℃，发酵时间为10d的情况下，以小肽含量为指标，实施例1的10ml/100g的液体菌种接种量为最佳接种量。

实施例1及对比例5～6的小肽含量测定结果如图6所示，可以看出9～13d的时候小肽含量呈现连续上升趋势，在发酵时间为13d时小肽含量达到11.16％。初步得出结论：蛹虫草固态发酵大豆在发酵温度为22℃，10ml/100g液体菌种接种量，以小肽含量为指标的情况下，实施例2的13d发酵时间为最佳。

2、sds-page电泳技术测定多肽分子量

(1)测定方法：称取发酵大豆肽1.0g，经5ml蒸馏水溶解、浸提、离心后取上清液待用，然后配制sds-page凝胶电泳所需要的胶。

10％下层胶：3.33ml30％丙烯酰胺溶液、2.5ml1.5μltris溶液ph＝8.8、100μl10％sds溶液、100μl10％ap溶液、8μltemed溶液、3.86ml蒸馏水。

5％上层胶：蒸馏水3.4ml、0.83ml30％丙烯酰胺溶液、0.63ml1.5μltris溶液ph＝6.8、50μl10％sds溶液、50μl10％ap溶液、5μltemed溶液。

电泳电压为200v，以未发酵的大豆蛋白液为对照。

其中，未发酵的大豆蛋白液的制备方法：参照实施例1的方法将大豆浸泡后灭菌，然后经冻干后超微粉碎，并过60目筛，取1.0g，经5ml蒸馏水溶解、浸提、离心后取上清液，即为未发酵的大豆蛋白液待用。

(2)测定结果如下：

不同样品的sds-page电泳结果如图7所示，标准蛋白maker的分子量为：15-130kda，泳道m为蛋白maker；泳道1为对照未发酵的大豆蛋白液；泳道2为对比例7制作的发酵大豆肽；泳道3～4为对比例5制作的发酵大豆肽；泳道5～6为对比例6制作的发酵大豆肽；泳道7～8为实施例1制作的发酵大豆肽；

由图7可以看出大豆在22℃，10ml/100g蛹虫草接种量的发酵条件下，随着发酵时间的增长，发酵大豆肽的分子质量越变越小，出现25kda以下的小肽，故而实施例2的发酵效果最佳。

3、发酵大豆肽溶解度的测定

(1)测定方法

在50ml的烧杯中放入精确称取的1g实施例1的发酵大豆肽样品，加入19ml水。使用磁力搅拌器均匀搅拌，用0.1～0.2mo1/lnacl在2min内将ph值调至预定值。待ph值稳定后再连续搅拌浸提25min，并将料液比配制为1g:20ml。待浸提完全后以3000r/min的速度离心，10min后取上清液测定氮含量，并换算成氮溶解指数值。

氮溶解指数＝可溶性氮含量/样品中总氮含量×100％

总氮含量＝(滴定样品用去的盐酸体积-滴定空白用去的盐酸体积)×0.001×14.008×100/1000×称量样品的质量；其中的体积单位为ml，称量样品的质量单位为g；

可溶性氮含量＝2×盐酸标准溶液浓度×样品消化液消耗盐酸标准溶液的体积×14×5.71/样品的质量；其中的体积单位为ml，溶液浓度为mol/l，称量样品的质量单位为g。

(2)测定结果如下：

不同ph环境下实施例1制作的发酵大豆肽和未发酵的大豆蛋白(本发明中所述未发酵的大豆蛋白制备过程如下：参照实施例1的方法将大豆浸泡后灭菌，然后经冻干后超微粉碎，并过60目筛，得到未发酵的大豆蛋白)的溶解度见表1，由表1结果可以看出未发酵的大豆蛋白液在酸性环境下溶解度降低，特别是在等电点ph4～6时几乎不溶解而沉淀。发酵大豆肽溶解度受ph值的影响很小，其在任何ph环境下都具有很好的溶解性，nsi值达到95％以上。

大豆蛋白的肽键被蛹虫草发酵切断后，羧基等的亲水性基团增多，溶解性得到提高，发酵大豆肽的分子量较小，不易聚集沉淀，粉末状的大豆肤成品可以在很短时间内溶解。因此在等电点(ph值为4～6)附近时，未发酵的大豆蛋白非常容易聚集沉淀，发酵大豆肽溶液则不受到影响。

表1不同ph环境下发酵大豆肽与未发酵的大豆蛋白的溶解度分布表

4、发酵大豆肽表观粘度的测定

(1)测定方法

精确称取25.0g样品，放入烧杯中，加500.00ml水，混匀，并使用磁力搅拌器以200r/min的速度振荡20分钟使其充分溶解，制成浓度5g/100ml的发酵大豆肽液备用。按照如上的方法同样制备10g/100ml、15g/100ml、20g/100ml、25g/100ml、30g/100ml浓度的发酵大豆肽液以及未发酵的大豆蛋白液(利用未发酵的大豆蛋白配制而成)。

然后运用用snb-1型旋转黏度计测定ph值为7.0，25℃的大豆肽液与未发酵的大豆蛋白液的表观粘度。

(2)测定结果如下：

实施例2发酵大豆肽和未发酵的大豆蛋白的表观粘度的测定结果如图8所示。当浓度在0～10g/100ml之间时，未发酵的大豆蛋白的表观粘度变化十分平缓且波动很小；当浓度高于10g/100ml时，其表观粘度呈直线上升状态。大豆肽溶液的浓度在1～25g/100ml范围内时，溶液粘度基本不受到溶液浓度的影响，溶液粘度变化幅度很小，即使浓度达到30g/100ml时，粘度也只有9.8mpa.s，所以大豆肽的粘度很小。

5、发酵大豆肽液乳化性及稳定性的测定

(1)测定方法：

制备不同浓度的大豆肽液后分别取100ml置于250ml的烧杯中，一边搅拌一边缓慢加入30ml食用油，均质5min后，制成乳状液。用移液枪吸取乳状液50μl，将其与25ml0.1％的sds溶液混合，充分摇匀后，使用分光光度计在550nm处测其吸光值(aod)，并以乳化性指数(eai＝aodx100)表示乳化性，15min后再次测定其吸光值(a'od)计算乳化稳定性。

乳化性指数(eai)＝a'od×100

乳化稳定性(eai)＝a'od/aod×t

t表示时间间隔，单位s。

(2)测定结果如下：

按照3的方法分别制备0.1g/100ml、0.5g/100ml、1.0g/100ml、3.0g/100ml的发酵大豆肽液以及0.1g/100ml、0.5g/100ml、1.0g/100ml、3.0g/100ml的未发酵的大豆蛋白液。不同大豆肽液乳化性及稳定性的测定结果如表2所示，由表2结果可知，与未发酵的大豆蛋白相比较发酵大豆肽的乳化性和乳化稳定性随着浓度的增长而增加，但大豆肽的乳化性和乳化稳定性要小于未发酵的大豆蛋白。

表2不同浓度未发酵的大豆蛋白和大豆肽液乳化性和乳化稳定性测定结果

需要说明的是，本发明对所述蛹虫草菌种不限制，只要菌株及其发酵产物对人身健康无害，均可用，比如采用江苏省食品生物加工工程技术研究中心所保存的蛹虫草菌种(cordycepsmilitaris)pm14。

需要说明的是，本发明中涉及到数值范围时，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。