本发明属于细胞核移植技术领域，尤其涉及一种细胞去核显微操作针及一种细胞去核的方法。
背景技术
哺乳动物的体细胞核移植，即体细胞克隆是近代生物技术和生命科学领域的一项具有划时代意义的重大突破，它证明了分化的体细胞能恢复其未分化状态，并发育为一个完整的个体。该技术在多种哺乳动物都获得成功，在家畜的遗传改良、乳腺生物反应器的制备和人类治疗性克隆等发明都具有广阔的应用前景。在体细胞核移植的程序中，卵母细胞核物质的去除，即去核是影响核移植总效率的重要技术环节之一。卵母细胞去核不完全将导致核移植重构胚中染色体倍数异常，最终胚胎因发育受阻而流产或死亡；另外卵母细胞能否耐受物理去核带来的机械损伤也严重影响着去核率。
目前核移植中普遍使用的去核方法是机械去核法，即通过显微操作机械性的去除卵母细胞中的核染色质，主要包括盲吸法、半卵去核法、切割去核法和高速离心去核法等。机械的去核方法都存在较高的技术要求，如果方法选择不当或操作不熟练，可能会对受体细胞质的微结构造成严重伤害；且操作时间较长，进而产生活性氧等有害物质，影响重组胚的发育。在机械去核中，去核针的选取对于去核率、操作时间和去核后卵母细胞的存活率有较大的影响。常用的去核针存在以下缺点：1.均为空心针，针的韧性降低，易折断。2.若针尖较小，在吸取含细胞核的卵胞质时极易堵塞针管，需频繁换阵，去核操作时间加长，效率低；若针尖较粗(为20μm左右)时，吸取的卵胞质较多，导致存在于胞质中的核重编程相关因子的丢失严重，进而重构胚的核重编程不完全和表观遗传遗传，胚胎的正常发育受阻。3.去核针锋利的切口，会破坏卵母细胞的细胞骨架和胞质膜等显微结构，造成卵母细胞的死亡和胚胎的发育停滞。4.使用针尖切口较小的去核针则需要两步操作，如挤压去核法，先将去核针扎入极体附近的透明带和卵胞质间的卵周隙中，在透明带形成切口后移出去核针；再将去核针移到卵母细胞上方，向下轻轻挤出极体及其周围的胞质；点击去核则是透明带切口后，用去核针点击卵母细胞透
明带一侧，达到去核目的。挤压法对细胞造成的伤害较小，操作耗时短，整体去核效率较高；而点击法在用去核针直接点击透明带时，去核针尖很容易进入透明带中，造成受体细胞的崩溃，同时也浪费操作时间。若用钝性的针去点击透明带，取得了较好的效果，但操作过程需要换针，耗时长，影响操作速度。总之，现有的去核针去核率低，对卵母细胞有较大的破坏，操作复杂，易断针。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种去核率高、操作简单、对卵母细胞损伤小的细胞去核显微操作针及细胞去核方法。
基于上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心；所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。
优选的，所述第一针管的长度为40～60μm；所述第一针管的外径为25～30μm。
优选的，所述第一针管为实心。
优选的，所述第二针管内设置角度为145～155°的弯曲拐点。
优选的，所述弯曲拐点设置在距第二针管与第一针管连接点1000～1800μm处。
优选的，第二针管内部自所述第二针管与第一针管连接点至所述弯曲拐点部分的外径为25～30μm。
优选的，第二针管内部所述弯曲拐点至第二针管与第三针管连接点部分的外径由25～30μm逐渐增大到1mm。
优选的，所述第二针管的长度为大于1400μm。
优选的，所述第三针管的内径为0.85～0.95mm，所述第三针管的外径为0.98～1.05mm。
本发明还提供了利用所述细胞去核显微操作针进行细胞去核的方法，包括以下步骤：1)将卵母细胞置于显微操作液中；2)在带有显微操作设备的倒置显微镜下，用固定针吸住所述卵母细胞；3)用所述细胞去核显微操作针拨动卵母细胞，调整卵母细胞中极体的位置于卵母细胞的“12点”位置；4)将细胞去核显微操作针从卵母细胞的“1点”位置扎入透明带下的卵周隙，从“11”点和“12”点之间的位置出来，挑破透明带，同时极体及周围的核物质被挤出透明带，实现去核。
与现有技术相比，本发明所述的细胞去核显微操作针具有以下优势：
本发明提供的细胞去核显微操作针包括顺次连接的针尖部分、第一针管和第二针管；所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心。本发明提供的细胞去核显微操作针的去核率高达86％以上，现有其它方法在60～75％之间，去核率大大提高。
本发明提供的细胞去核显微操作针，针尖部分为实心，增加了细胞去核显微操作针的韧性，不易断针。本发明提供的细胞去核显微操作针一步即可完成卵母细胞的去核，即透明带切口和挤压一次性完成，且不需要换针，操作时间短，效率高。
利用本发明所述的细胞去核显微操作针进行细胞去核的方法，去核操作时，细胞去核显微操作针只扎入透明带和卵周隙，对卵母细胞质膜及骨架结构的破坏较小，去核后卵母细胞的存活率高，去核率和核移植重构胚的发育率高。
本发明所述的细胞去核方法，挤出的包含核物质的细胞质较少，只占卵母细胞质的十分之一左右，胞质中核重编程因子的损失较小，有利于体细胞核的重编程，重构胚的发育率高。
附图说明
图1为实施例1中细胞去核显微操作针的结构示意图。
具体实施方式
一种细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；结构如图1所示，其中1为针尖部分，2为第一针管，3为第二针管，4为弯曲，5为第三针管。所述针尖部分的长度为40～50μm；所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm；所述针尖部分为实心。所述第一针管和第三针管为直管；所述第二针管为弯管。
在本发明中，所述细胞去核显微操作针，优选为玻璃针，更优选为以毛细玻璃管为原料制成。在本发明中，所述细胞去核显微操作针包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为40～50μm，优选为42～48μm，更优选为45μm；本发明中，所述针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；所述针尖前端外径为1μm，所述针尖尾端外径为3～5μm，优选为3.5～4.5μm。本发明中所述针尖尾端与第一针管前端直接相连，所述第一针管优选长度为40～60μm，更优选为45～55μm；所述第一针管的外径优选为25～30μm，更优选为26～29μm。本发明中，所述第一针管优选为实心。
本发明中，所述第一针管的尾端与第二针管的前端直接相连；所述第二针管内设置角度为145～155°的弯曲拐点；优选的，所述弯曲拐点优选的设置在距第二针管与第一针管连接点1000-1800μm处，更优选为1400μm处。本发明中，设置所述弯曲的作用是使得针尖和第一针管部分能与卵母细胞的中心在同一个平面，利于去核操作时卵母细胞不会随意移动，提高去核的准确率和效率。本发明中第二针管内部自所述第二针管与第一针管连接点至所述弯曲拐点部分的外径为25～30μm；第二针管内部所述弯曲拐点至第二针管与第三针管连接点部分的外径由25～30μm逐渐增大到1mm。本发明中所述第二针管的长度为大于1400μm，优选的为1400～9900μm。
本发明中，所述第二针管的尾端与第三针管的前端直接相连；所述第三针管的内径优选为0.85～0.95mm，更优选为0.9mm；所述第三针管的外径优选为0.98～1.05mm，更优选为1mm。本发明中所述第三针管的长度优选为43～47mm，更优选为44～46mm，最优选为45mm。
本发明中，所述细胞去核显微操作针的总长度优选为53～58mm，更优选为55mm；所述细胞去核显微操作针使用后优选的用温和清洗剂清洗；清洗后用乙醇消毒，消毒后可重复使用。
本发明中，所述细胞去核显微操作针优选的毛细玻璃管为原材料，通过拉针仪拉制。本发明中，所述毛细玻璃管的规格优选为1mm(外径)×0.9mm(内径)×100mm(长度)。
本发明中所述细胞去核显微操作针的制备方法包括以下步骤：a)用50～55℃加热铂金丝上的玻璃球将拉制后的空心毛细玻璃针烧融至其外径为25～30μm处停止，获得预制玻璃针；b)保持所述玻璃球的温度，缓慢向上移动预制玻璃针40-60μm，烧融实心的第一针管，所述第一针管的外径为25～30μm；c)持续保持所述玻璃球的温度，迅速向上移动预制玻璃针40-50μm，使其外径从3-5μm逐渐减小到1μm，形成针尖部分。d)在距离针尖1100～1900μm处，将铂金丝上玻璃球靠近玻璃针，加热铂金丝，使玻璃针形成145～155°角的弯曲。
本发明还提供了利用所述细胞去核显微操作针进行细胞去核的方法，包括以下步骤：1)将卵母细胞置于显微操作液中；2)在带有显微操作设备的倒置显微镜下，用固定针吸住所述卵母细胞；3)用所述细胞去核显微操作针拨动卵母细胞，调整卵母细胞中极体的位置于卵母细胞的“12点”位置；4)将细胞去核显微操作针从卵母细胞的“1点”位置扎入透明带下的卵周隙，从“11”点和“12”点之间的位置出来，挑破透明带，同时极体及周围的核物质被挤出透明带，实现去核。
在本发明中，首先将所述卵母细胞置于显微操作液中，所述卵母细胞优选的在显微操作液中成直线排列。本发明对所述显微操作液没有特殊限定，采用本领域常规的显微操作液即可。本发明中所述卵母细胞优选为第一极体已经排出或明显突起的卵母细胞。
本发明在带有显微操作设备的倒置显微镜下，用固定针吸住所述卵母细胞。本发明对所述固定针没有特殊限定，采用本领域常规的固定针即可。本发明中所述固定针吸住卵母细胞的过程，动作轻柔，防止卵母细胞被机械所伤。
本发明在固定针吸住卵母细胞后，用所述细胞去核显微操作针拨动卵母细胞，调整卵母细胞中极体的位置于卵母细胞的“12点”位置。本发明中所述的位置有利于细胞去核显微操作针扎入卵母细胞透明带下的卵周隙。本发明在调整卵母细胞位置后，将细胞去核显微操作针从卵母细胞的“1点”位置扎入透明带下的卵周隙，从“11”点和“12”点之间的位置出来，挑破透明带，同时极体及周围的核物质被挤出透明带，实现去核。本发明整个去核过程中细胞去核显微操作针优选的不接触卵母细胞的胞质膜。
本发明在所述去核完成后，优选的还包括将卵母细胞与极体和核物质分离，并将卵母细胞移入tcm199+10％fbs小滴中，极体和核物质移入染色滴(浓度为10μg/μlh33342)。本发明中，所述分离通过口吸管实现。
本发明优选的10分钟后将上述染色滴在荧光显微镜下观察极体和核物质，能观察到核物质的小滴，其对应的卵母细胞为完全去核，否则为去核失败；本发明在去核操作后，细胞膜破裂，胞质分散的为死亡卵母细胞；统计完全去核卵母细胞的数量，计算去核率(去核率＝完全去核卵母细胞数/去核操作的卵母细胞数)和死亡率(死亡率＝死亡卵母细胞数/去核操作的卵母细胞数)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
细胞去核显微操作针(简称去核针)，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；结构如图1所示，其中1为针尖部分，2为第一针管，3为第二针管，4为弯曲、5为第三针管。所述针尖部分的长度为50μm；针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；针尖前端为1μm，针尖尾端为4μm，所述针尖部分为实心；第一针管长度为50μm，外径为28μm，第一针管为实心；第二针管长度为9900μm，第二针管为空心，在距第二针管与第一针管连接点1400μm处设置弯曲，所述弯曲使得弯曲后的针管与针尖部分/第一针管之间呈150°角。第二针管弯曲拐点前的外径为28μm，弯曲拐点后的外径由28μm逐渐增大到1mm，第二针管尾端与第三针管前端直接相连，第三针管长度为45mm，内径0.9mm，外径1mm。
制作方法：
1.规格为1mm(外径)×0.9mm(内径)×100mm(长度)的毛细玻璃管用拉针仪拉制；
2.将毛细玻璃管固定于锻针仪上，于锻针仪目镜的视野内将毛细玻璃管和加热铂金丝的玻璃球调整到一个纵切面，并使玻璃球位于毛细玻璃管的正下方；
3.调高铂金丝上玻璃球的温度至50-55℃，从针尖开始烧融玻璃针，同时向下缓慢移动玻璃针，直到玻璃针的外径为28μm处停止移动；
4.然后保持铂金丝上玻璃球的高温状态，缓慢地向上移动玻璃针50μm，并使得这段实心玻璃针的外径为28μm；
5.持续保持玻璃球的高温状态，迅速向上移动玻璃针50μm，使其外径从4μm逐渐减小到1μm，形成针尖。
6.在距离针尖1500μm处，将铂金丝上玻璃球靠近玻璃针，加热铂金丝，玻璃针形成150°角的弯曲；
7.乙醇消毒后备用。
实施例2
细胞去核显微操作针，包括顺次连接的针尖部分、第一针管、第二针管和第三针管；所述针尖部分的长度为45μm；针尖部分的外径自针尖前端至针尖尾端逐渐增大；针尖前端为1μm，针尖尾端为5μm，所述针尖部分为实心；第一针管长度为55μm，外径为30μm，第一针管为实心。第二针管长度为8900μm，第二针管为空心，在距第二针管与第一针管连接点1400μm处设置弯曲，所述弯曲使得弯曲后的针管与针尖部分/第一针管之间呈150°角。第二针管弯曲拐点前的外径为28μm，弯曲拐点后的外径由28μm逐渐增大到1mm，第二针管尾端与第三针管前端直接相连，第三针管长度为45mm，内径0.9mm，外径1mm。
制作方法：
1.规格为1mm(外径)×0.9mm(内径)×100mm(长度)的毛细玻璃管用拉针仪拉制；
2.将毛细玻璃管固定于锻针仪上，于锻针仪目镜的视野内将毛细玻璃管和加热铂金丝的玻璃球调整到一个纵切面，并使玻璃球位于毛细玻璃管的正下方；
3.调高铂金丝上玻璃球的温度至50-55℃，从针尖开始烧融玻璃针，同时向下缓慢移动玻璃针，直到玻璃针的外径为30μm处停止移动；
4.然后保持铂金丝上玻璃球的高温状态，缓慢地向上移动玻璃针55μm，并使得这段实心玻璃针的外径为30μm；
5.持续保持玻璃球的高温状态，迅速向上移动玻璃针45μm，使其外径从5μm逐渐减小到1μm，形成针尖。
6.在距离针尖1500μm处，将铂金丝上玻璃球靠近玻璃针，加热铂金丝，玻璃针形成150°角的弯曲；
7.乙醇消毒后备用。
实施例3
利用实施例1中的细胞去核显微操作针进行卵母细胞去核操作(简称简化去核法)
1.将第一极体已经排出或明显突起的卵母细胞移入显微操作液，并依次排列成一条直线；
2.在带有显微操作设备的倒置显微镜下，先用固定针轻轻吸住卵母细胞；
3.用去核针拨动卵母细胞细胞，调整极体的位置于卵母细胞的“12点”位置；4.将去核针从卵母细胞的“1点”位置扎入透明带下的卵周隙，从“11”点和“12”点之间的位置出来，挑破透明带，同时极体及周围的核物质被挤出透明带；注意整个过程中去核针不能接触卵母细胞的胞质膜；
5.用口吸管将卵母细胞与极体和核物质分开，并一一对应地将卵母细胞移入tcm199(gibco公司)+10％fbs(gibco公司)小滴中储存，极体和核物质移入染色滴(浓度为10μg/μlh33342(sigma公司))进行dna的染色；
6.10分钟后在染色滴在荧光显微镜下观察极体和核物质，能观察到核物质的小滴，其对应的卵母细胞为完全去核，否则为去核失败；去核操作后，细胞膜破裂，胞质分散的为死亡卵母细胞；统计完全去核卵母细胞的数量，计算去核率(去核率＝完全去核卵母细胞数/去核操作的卵母细胞数)和死亡率(死亡率＝死亡卵母细胞数/去核操作的卵母细胞数)。
实验结果见表1
表1采用实施例1中的去核针获得的去核率和重构胚胎的发育率
实施例4
分别使用实施例1中的去核针，实施例3的简化去核法、使用带切口的去核针的盲吸法和传统的挤压去核法等三种方法进行去核，比较其去核率和重构胚胎的体外发育率。结果见表2。可见，简化去核方法的死亡率远低于盲吸法，与挤压去核法相当；对于操作时间，则简化去核法所用时间较短；对于去核率和囊胚率，则简化去核法高于其它两种方法。整体上，简化去核的效率优于其他方法。
表2三种去核方法去核结果的比较
由上述实施例可知，本发明所述的细胞去核显微操作针进行卵母细胞的去核，去核时间短、去核率高，操作简单，去核后卵母细胞的存活率高，核移植重构胚的发育率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。