一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法与流程

本发明涉及一种基于数字pcr的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阿胶是采用马科动物驴的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩、并加入各类辅料制成的固体胶类药物，也被称为驴皮胶。其与人参、鹿茸三者一起被称为“中药三宝”，首载于《神农本草经》，并被列为上品。阿胶具有滋阴补血，润燥，止血的功效，其补血功效已被证实。除补血外，阿胶在增强免疫力、抗疲劳、抗辐射、抑制肿瘤、保护大脑、促进骨愈合生长以及保护心血管等方面的功效都已被证实。由于其重要性，阿胶产业现已融入健康中国发展战略。

目前，阿胶行业进入了空前的发展期，市场增幅逐年提高，从而让驴皮处于供不应求的局面。然而，我国驴存量逐年下降，行业驴皮资源紧张，原料供应严重不足。在巨大利益的诱惑下，以其他动物廉价皮甚至工业明胶冒充驴皮等故意制假售假现象严重。这种方式熬制出来的“假阿胶”虽在外观、气味、质地、口感等方面与真阿胶无明显差异，但阿胶纯度低。有些掺假阿胶甚至威胁人体健康，严重扰乱了阿胶市场秩序。当前，阿胶的真假鉴别和纯度鉴定是该行业急需解决的瓶颈难题。

为解决阿胶行业存在的种种问题，辨别阿胶真伪，许多学者已做了大量卓越的工作，开创了各类检测方法，包括高效液相色谱法、高效液相质谱法、光谱法、酶联免疫法、电泳法以及分子生物学方法等。这些方法能有效辨别阿胶是否掺假，但无法对阿胶纯度进行评估，因此依然无法对阿胶的品质进行评价。要从根本上解决阿胶行业存在的问题，不仅要进行定性分析，更重要的是对阿胶定量分析。由于技术上的难点，目前行业内阿胶定量分析研究极少，几乎处于研究空白。

技术实现要素：

为解决上述技术难题，本发明提供了一种基于数字pcr的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法。该方法可实现阿胶的绝对定量，准确、高效、稳定，可对市场上阿胶产品进行纯度测定，从而突破现阶段无法对阿胶及其相关产品进行纯度评价的难题。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种基于数字pcr的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)纯品阿胶质量与dna浓度含量测定及关系确定：分别提取不少于10个质量梯度的阿胶标准品dna，每个质量梯度重复3次；并利用紫外分光光度核酸定量测定仪测定标准品dna浓度，确定出在一定质量范围内的纯品阿胶质量与dna浓度含量的线性关系，并列出纯品阿胶质量与dna浓度含量关系方程式为y＝ax±b，相关系数需满足r²≥0.990，其中y是阿胶dna浓度含量(ng/μl)，x是纯品阿胶质量(mg)；

(2)阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数测定及关系确定：在数字pcr检测的浓度范围内，分别稀释至并选取10个质量梯度的阿胶标准品dna进行数字pcr检测，每个浓度梯度重复3次；确定出在一定的阿胶dna浓度范围内，dna质量含量与目的基因拷贝数之间的线性关系，并列出关系方程式为y＝cx±d，相关系数需满足r²≥0.990，其中y是目的基因拷贝数(copies/μl)，x为反应体系中阿胶dna质量含量(ng)；

(3)纯品阿胶质量与目的基因拷贝数关系确定：根据步骤(1)确立的纯品阿胶质量与阿胶dna浓度含量之间的关系，以及步骤(2)确立的阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数之间的关系，以阿胶dna含量为中间过渡换算值，确定出纯品阿胶质量与目的基因拷贝数之间的线性关系，并列出关系方程式为m阿胶＝ec±f；其中，m阿胶为纯品阿胶质量，单位mg；c为每微升的目的基因拷贝数，单位copies/μl；

dna浓度含量和质量含量的中间过渡关系式为x＝v*y/n，其中v为扩增体系中dna的上样体积，n为dna模板的稀释倍数；

(4)待测阿胶产品的定量确定：利用数字pcr检测待测样品中基因拷贝数，采用步骤(3)所述关系式换算出相应纯品的阿胶理论质量，所述阿胶的理论质量与进行dna提取的阿胶总质量的比值即为待测阿胶的纯度。

优选的，所述数字pcr的扩增体系为：采用20μl体系，上下游引物各1.8μl，探针0.8μl，数字pcrmix10μl，模板4μl，无菌水补齐至20μl；利用微滴生成器将20μl反应液生成不低于15000个dna模板和试剂随机分布的微滴；数字pcr反应程序如下：95℃10min；94℃30s；60℃1min；98℃10min；40个循环，4℃保存，最后用微滴分析仪对扩增产物进行分析。

本申请有益效果：

(1)本发明的方法不依赖标准曲线和对照、不受pcr抑制物及pcr效率的影响，通过单分子计数方式实现基因拷贝数的定量，是绝对意义上的定量。

(2)本方法立足于解决企业生产及检测过程中遇见的实际困难，建立的方法具有高效、灵敏、准确和稳定的特点。

(3)该技术可填补国内该方面检测空白，缓解市场中阿胶及相关产品造假严重的突出现状，亦可为政府监管提供依据及科技支撑，该研究具有广阔的应用前景，并可产生可观的经济效益，对阿胶行业发展将起到引领和重要的示范作用。

(4)本发明建立的基于ddpcr的阿胶定量检测方法准确、高效、稳定，有较大的应用价值和应用前景，可有效预防阿胶掺假现象的发生。

附图说明

图1为实施例中阿胶质量与相应dna浓度含量的关系图；

图2为实施例中阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数的关系图。

具体实施方式

本申请应用数字pcr(ddpcr)实现对阿胶绝对定量的方法，该方法分为3部走：(1)确立阿胶质量与dna浓度含量的关系；(2)确立阿胶dna质量含量与拷贝数的关系；(3)根据上述确立阿胶质量与拷贝数的关系，利用这个关系式进行检测。

下面结合具体实施例对本申请作进一步的说明。

实施例

一种基于数字pcr的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，步骤如下：

(1)纯品阿胶质量与dna浓度含量测定及关系确定

分别提取20、40、60、80、100、120、140、160、180、200mg共10个质量梯度的标准品阿胶粉末进行dna基因组的提取，实验步骤和操作保持严格一致，每个质量梯度重复3次；并利用紫外分光光度核酸定量测定仪测定标准品dna浓度，确定出阿胶在20～200mg质量范围内，如图1所示，阿胶质量与相应质量提取到的dna浓度含量之间呈现线性关系，关系式为y＝1.3449x-2.4333，相关系数r²可达0.9963，相关性明显。其中y是阿胶dna浓度含量(ng/μl)，x是纯品阿胶质量(mg)；

(2)阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数测定及关系确定

依据测定后的阿胶dna浓度对样品dna进行梯度稀释，分别稀释至并选取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/μl共10个质量梯度的阿胶标准品dna进行ddpcr检测，从而确定各浓度梯度的目的dna拷贝数，每次模板稀释5倍后选用4μl进行ddpcr检测，每个浓度梯度重复3次，ddpcr在检测过程中，每个样品的微滴生成量均在15000以上，完全满足定量检测的需求，图2为阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数的关系图，从图2中可以看出，在选用的阿胶dna浓度范围(10～100ng)内，即阿胶dna质量在40～400ng质量范围内，dna质量含量与目的基因拷贝数之间呈现线性关系，关系式为y＝7.4216x-6.328，相关系数r²可达0.9945，相关性明显。其中y是目的基因拷贝数(copies/μl)，x为反应体系中阿胶dna质量含量(ng)；

(3)中间过渡关系式的确定：在上面两个关系式中，y为阿胶dna浓度含量，单位为ng/μl；x为反应体系中实际加入的阿胶dna质量含量,单位为ng。提取dna后，通过简单的模板量的调整，找出dna浓度含量和最终实验中的dna质量的关系，具体的一是需对模板浓度进行调整，二是不同反应体系需根据模板浓度确定不同的dna上样体积。因此dna质量含量与浓度含量的关系应为x＝v*y/n，其中v为扩增体系中dna的上样体积，n为dna模板的稀释倍数。在本例中，dna上样体积为4μl，稀释倍数为5，因此x＝4*y/5。

(4)阿胶质量与目的基因拷贝数关系确定

根据步骤(1)确立的阿胶质量与dna浓度含量之间的关系，以及步骤(2)确立的阿胶dna质量含量与目的基因拷贝数之间的关系，以阿胶dna含量为中间过渡换算值，即步骤(3)确立的关系式x＝4*y/5，确定出阿胶质量与目的基因拷贝数之间的线性关系为m阿胶＝0.13c+3.05。其中，m阿胶为阿胶的质量(mg)，c为每微升的目的基因拷贝数(copies/μl)；

(5)待测阿胶产品的定量确定

利用数字pcr检测待测样品中基因拷贝数，采用步骤(4)所述关系式换算出相应纯品的阿胶理论质量，所述阿胶的理论质量与进行dna提取的阿胶总质量的比值即为待测阿胶的纯度。

试验例不同阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测

使用本申请建立的ddpcr阿胶定量检测方法，对市场内销售的的8款阿胶以及2款阿胶附属产品阿胶速溶粉进行定量检测，计算每个阿胶产品纯度。

样品处理：取新开封阿胶或阿胶相关产品于分析研磨机中研磨，如样品不易处理，可用液氮研磨；样品磨成粉后于烘箱中85℃烘24h进行样品称取；将阿胶纯品作为标准品，其他8个阿胶及2个市售阿胶粉经处理作为待测品；其中，样品处理过程中不同样品隔离处理，严防交叉污染。

ddpcr检测驴源性成分引物探针检测阿胶中驴源性成分的引物探针序列f：5’-aatagctctagccgtacggctaact-3’，r：5’-caggataatgaatgtaataagggctg-3’，探针：5’-fam-tgccggacatcttctaatccacctt-eclipse-3’。

其中，dna提取试剂盒购自德国凯杰(qiagen)公司；驴源性引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司(takara)合成；ddpcrmastermix购自美国伯乐(bio-rad)公司。

每个样品经dna提取后，稀释5倍检测，重复3次，结果如表1所示。

表1市场内阿胶与阿胶相关产品的定量分析

由表1可看出，现市场上销售的各类阿胶及其产品质量参差不齐，纯度有较大差异。本申请开发的ddpcr方法能够进行阿胶及其相关产品中阿胶含量的定量检测，可以用来进行阿胶及相关产品的掺假和纯度鉴定，有很高的实用性。利用该方法对市场上阿胶产品进行随机检测能对市售的阿胶产品进行定量检测和纯度鉴定，且不同阿胶产品纯度有明显的差异。本发明建立的基于ddpcr的阿胶定量检测方法准确、高效、稳定，有较大的应用价值和应用前景，可有效预防阿胶掺假现象的发生。