本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白，本发明还涉及一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的构建方法与应用。
背景技术
表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)具有促进表皮细胞增殖等多种功效。人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor，hegf)是一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽，其分子量为6kda，等电点pi为4.2。hegf分子的稳定性较高，能耐受酸、碱、热以及胃蛋白酶和胰蛋白酶等的作用。大量研究证实hegf具有刺激表皮细胞增殖和分化的能力，能通过促进表皮细胞内dna的合成，加速新细胞取代老化细胞的进程，增加细胞对其他内源性生长因子的摄取，促进细胞分泌透明质酸和糖蛋白，从而恢复表皮的光滑和弹性、延缓皮肤衰老、减少皱纹，hegf将在美容护肤方面具有十分重要的意义。此外，当表皮发生损害后，hegf还可与细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)特异性结合，启动egf/egfr信号转导通路，加速表皮细胞的增殖并刺激其分化成熟，从而修复受损皮肤。
天然的egf稀少、难以穿过皮肤、易被免疫系统清除，从而限制了它的应用。天然hegf资源很少，且产量低，因而价格昂贵；作为一种生物活性蛋白，溶液中的hegf活性也只能维持1周左右，所以很难将其直接作为添加剂使用；更难以解决的是hegf的生物利用度低，因为该分子本身并不具备有效穿过表皮的能力，而且还容易被皮肤内的免疫系统清除，这些问题都掣肘了hegf的应用。如何解决这些问题和瓶颈，是egf得以广泛使用的前提。
针对以上问题，目前的解决渠道有三种：一是采用基因工程技术可获得低价高产的hegf；二是tat蛋白转导技术；三是cd47具有减轻免疫系统的非特异性免疫应答反应的功能。
蛋白转导技术是近些年来运用比较广泛的一项技术，可使分子量超过100kd的蛋白质或其他大分子物质穿过细胞膜，甚至穿过血脑屏障和血脊屏障。研究证实一种来源于人类ⅰ型免疫缺陷病毒(hiv-i)的转录反式激活因子(trans-activatoroftranscription，tat)的蛋白转导域(proteintransductiondomain，ptd)，能够将分子量在15～120kd的不同生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)高效、快速、安全地导入细胞，且导入后仍具有生物活性，并对宿主细胞几乎没有毒性。tat蛋白转导域的发现为蛋白质治疗带来了新的曙光，显示出巨大的应用价值。目前，tat蛋白转导技术已经成功将bdnf、nep1-40、gdnf、bcl-2、jip等功能蛋白转导进入脑组织和神经元。tat蛋白结构域修饰的蛋白质药物目前已经用于二期临床的试验。克里姆比尔神经医学中心的m.tymianski博士将tat-nr2b9c(c-terminal9aminoacidsofn-methyl-d-aspartatereceptors-2b)用于因脑动脉瘤而引发轻微中风的患者，结果显示90％以上的患者不会引起明显的神经性伤残。92位患者接受tat-nr2b9c治疗，93位接受安慰剂治疗，没有发现tat-nr2b9c引起的严重不良反应事件，表明tat介导的蛋白质药物是安全的，这是人类首次将tat修饰的蛋白药物用于临床研究，表明tat作为介导蛋白质药物在临床的应用成为可能。近年来的研究表明，9个连续的arg多肽同样具有蛋白转导的功能，且转导速度是tat的9倍，将其命名为改良的tat(modifiedtat，mtat)，其序列为rrrrrrrrr。
cd47具有减轻免疫系统的非特异性免疫应答反应的功能。cd47又称整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein，iap)是一种广泛分布于多种细胞膜表面上的高度糖化的跨膜蛋白。cd47通过与其配体--信号调节蛋白α(sirpα)形成cd47-sirpα信号复合体，产生能降低巨噬细胞活性的抑制性信号，从而减轻免疫系统的非特异性免疫应答反应。cd47能抑制巨噬细胞活性的关键功能区gnytsevteltregetiielk，将其命名为cd47关键结构域(keydomainofcd47，kcd47)，通过将kcd47和hegf融合表达，达到抑制皮肤内免疫系统的非特异性免疫应答反应，从而有效维持hegf的作用浓度。
基于上述分析，将mtat、kcd47与hegf融合表达，获得一个既具有蛋白转导功能又具有抗免疫清除能力的新的hegf融合蛋白mtat-hegf-kcd47。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白，解决了大分子蛋白质不能主动穿透表皮、易被皮肤内的免疫系统清除的问题。
本发明的第二个目的是提供一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的应用。
本发明所采用的第一个技术方案是，一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白，mtat-hegf-kcd47融合蛋白的cdna序列如序列1所示。
本发明的特征在于，
mtat-hegf-kcd47融合蛋白的蛋白质序列如序列2所示。
mtat-hegf-kcd47融合蛋白中，mtat为具有连续的9个连续的arg多肽，其氨基酸的序列rrrrrrrrr。
kcd47具体为cd47能抑制巨噬细胞活性的关键功能区gnytsevteltregetiielk。
本发明所采用的第二个技术方案是，一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，构建mtat+hegf+kcd47载体
取用genebank基因库中tat、hegf和cd47已知序列为基础，在序列的n端加上rrrrrrrrr，中间通过sgpg连接肽连接，模板序列设计为：mtat+hegf+kcd47；
采用载体ptrchis，使用bamhi和xhoi双酶切穿梭ptrchis质粒，得到载体大片段，将所述模板序列与载体大片段连接，得到重组穿梭质粒，测序正确后构建成功mtat+hegf+kcd47的表达载体，即得到ptrchis-mtat+hegf+kcd47；
步骤2，mtat+hegf+kcd47蛋白表达及纯化
将构建成功的步骤1的ptrchis-mtat+hegf+kcd47转化入大肠杆菌bl21菌株中，挑选3-5个阳性菌类克隆在氨苄抗性的lb培养基中培养，采用iptg诱导蛋白；
将诱导后的全菌蛋白依次经过sds-page和考马斯亮蓝r250染色后，确定诱导表达条件和阳性菌落克隆，在37℃，0.5mmiptg条件下表达mtat+hegf+kcd47融合蛋白；
将诱导表达mtat+hegf+kcd47融合蛋白的细菌经过超声破碎后，通过ni离子交换柱亲和纯化mtat+hegf+kcd47融合蛋白，完成融合过程。
本发明的特征还在于，
步骤1中mtat+hegf+kcd47的表达载体的基因编码序列如序列表3所示。
步骤1中bamhi和xhoi双酶切切入点分别为：
bamhi酶切入点为序列表3中第1-6个核苷酸处，
xhoi酶切入点为序列表3中第286-291个核苷酸处。
本发明所采用的第三个技术方案是，一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白在制备促进表皮增殖的药物及护肤品中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明mtat-hegf-kcd47融合蛋白，将mtat、kcd47与hegf融合表达，同时选用大肠杆菌偏好的密码子，在计算机辅助下设计出mtat-hegf-kcd47的全基金组序列，人工合成后连接入ptrchisb表达载体，构建成功mtat-hegf-kcd47重组表达质粒载体，经表达、纯化获得具有生物学活性的mtat-hegf-kcd47融合蛋白，且具有低成本、高活性、作用时间久的优点；
(2)本发明mtat-hegf-kcd47融合蛋白，具有tat可进行蛋白传送的特点，有效解决了大分子蛋白质不能主动穿透表皮的问题，同时也解决了该分子易被皮肤内的免疫系统清除的难题；将mtat基因、cd47基因与外源蛋白hegf连接，表达融合蛋白mtat-hegf-kcd47，不仅保留了tat原有的穿透力和cd47的抑制非特异性免疫应答的作用，且对外源蛋白hegf的活性几乎没有影响，使mtat-hegf-kcd47融合蛋白，在hegf的应用中具有广阔的前景。
附图说明
图1是本发明一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的表达纯化示意图，
其中，泳道1表示蛋白maker，泳道2表示iptg诱导前的mtat-hegf-kcd47菌液，泳道3表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47菌液，泳道4表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47细菌破碎上清液，泳道5表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47菌液破碎液沉淀，泳道6表示纯化后的mtat-hegf-kcd47重组蛋白；
图2是本发明一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白促进表皮细胞增殖的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实验过程
一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，构建mtat+hegf+kcd47载体
取用genebank基因库中tat、hegf和cd47已知序列为基础，在序列的n端加上rrrrrrrrr，中间通过sgpg连接肽连接，全序列委托金斯瑞生物公司合成。模板序列设计为：tat+hegf+kcd47；
采用载体ptrchis，使用bamhi和xhoi双酶切穿梭ptrchis质粒，得到载体大片段，将模板序列与载体大片段连接，得到重组穿梭质粒，测序正确后构建成功mtat+hegf+kcd47的表达载体，即得到ptrchis-tat+hegf+kcd47，mtat+hegf+kcd47的表达载体的基因编码序列如序列表3所示。
其中bamhi和xhoi双酶切切入点分别为：bamhi酶切入点为序列表3中第1-6个核苷酸处，xhoi酶切入点为序列表3中第286-291个核苷酸处。
步骤2，mtat+hegf+kcd47蛋白表达及纯化
将构建成功的步骤1的ptrchis-mtat+hegf+kcd47转化入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，挑选3-5个阳性菌类克隆在氨苄抗性的lb培养基中培养，采用iptg诱导蛋白；
将诱导后的全菌蛋白依次经过sds-page和考马斯亮蓝r250染色后，确定诱导表达条件和阳性菌落克隆，在37℃，0.5mmiptg条件下表达mtat+hegf+kcd47融合蛋白；
将诱导表达mtat+hegf+kcd47融合蛋白的细菌经过超声破碎后，通过ni离子交换柱亲和纯化tat+hegf+kcd47融合蛋白，完成融合过程。
如图1所示，为mtat-hegf-kcd47融合蛋白的表达纯化示意图，其中，泳道1表示蛋白maker，泳道2表示iptg诱导前的mtat-hegf-kcd47菌液，泳道3表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47菌液，泳道4表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47细菌破碎上清液，泳道5表示iptg诱导后的mtat-hegf-kcd47菌液破碎液沉淀，泳道6表示纯化后的mtat-hegf-kcd47重组蛋白。
由上可知，得到的mtat-hegf-kcd47融合蛋白的cdna序列如序列1所示；mtat-hegf-kcd47融合蛋白的蛋白质序列如序列2所示。将tat与egf融合表达，能穿透表皮，发挥egf促新生表皮细胞合成，并应用于表皮的修复和更新；将kcd47和hegf融合表达，达到抑制皮肤内免疫系统的非特异性免疫应答反应，延长融合蛋白半衰期，增加融合蛋白发挥功效的时间。
进行mtat-hegf-kcd47融合蛋白促进表皮生长的实验
将mtat+hegf+kcd47融合蛋白
将表皮细胞hsf(人皮肤成纤维细胞)和hse(早代人皮肤上皮细胞)以10000个/孔种96孔板中，细胞贴壁后加入mtat+hegf+kcd47融合蛋白，作用浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml，每个浓度重复5次，作用24h后，用cck-8测量细胞增殖情况，结果如图2所示：发现tmtat+hegf+kcd47融合蛋白可显著促进表皮细胞的增殖。
本发明mtat-hegf-kcd47融合蛋白不仅保留了tat原有的穿透力和cd47的抑制非特异性免疫应答的作用，且对外源蛋白hegf的活性几乎没有影响，使其在在制备促进表皮增殖的药物及护肤品中具有广阔的前景。
序列表
<110>西安医学院
<120>一种mtat-hegf-kcd47融合蛋白及构建方法与应用
<130>无
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>277
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cgccgtcgccgccgccgtcgccgtcgctcgggtccgggtaactcagattccgaatgtccg60
ctgtcgcacgatggctattgcctgcatgatggcgtctgcatgtatattgaagcgctggac120
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aaatggtgggaactgcgtagcggtccgggtctcgagggtaactacaccagcgaagtgacc240
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<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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