一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法与流程

本发明涉及天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法。

背景技术

随着人口的老龄化，阿尔茨海默病(ad)的发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。阿尔茨海默病(ad)的确切致病机制目前尚未十分清楚，基于“胆减能假说”已开发出的胆碱酯酶抑制剂（多奈呢齐、加兰他敏和利伐司替明）是当前治疗的重要药物，是ad药物治疗的主要手段，用于治疗阿尔兹海默症的药物目前国内也常用石杉碱甲。临床证实这些抑制刻对轻度至中度的患者有效但是对于中重度的疗效不佳，而且伴有一定的副作用以及耐药性等问题。另一方面，本身病情的复杂性，仅针对一种病理现象或靶标设计研发的药物已不能满足广大患者的实际治疗需要。因此寻找和发现具有全新作用机制的治疗药物具有重要的科学意义和应用价值。

研究生物活性肽是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。其中，鲎血资源珍贵，蛋白含量高，含有人体所必须的8种必须氨基酸以及多种微量元素，存在着多种具有抗菌抗内毒素的小分子活性多肽。而提取鲎血分离变形细胞后剩余的鲎血浆，由于铜含量超出人类食用标准，一般作为废物被丢弃，造成了极大的浪费。因此研究鲎血血细胞蛋白活性肽及其制备方法意义重大。

将鲎血浆制备成活性肽，充分利用了废弃的鲎血浆，又可制备成各种有效药物或保健品，具有较大的推广应用价值。对比文件cn106148465a公开了一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用，将鲎血浆于70～100℃条件下恒温水浴2～4小时，然后将鲎血浆抽滤并用水洗涤，备用；使用蛋白酶水解所得鲎血浆，然后将鲎血浆水解液离心分离得上清液备用；将所得上清液过sephadexg-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽。该方法得到的鲎血蛋白水解肽，具有较高的dpph自由基清除能力和总抗氧化能力，但没能产生乙酰胆碱酯酶或没能提供对乙酰胆碱酯酶的抑制率实验数据，也没有提供具体的肽得率，因此无法具体实施应用到阿尔茨海默病的药物和保健品或具体的某些药物应用方面。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，该方法从废弃的鲎血细胞膜组织中制备得到的鲎血血细胞蛋白活性肽，既能有效清除羟自由基又能抑制乙酰胆碱酯酶，还可作为阿尔茨海默病的药物和保健品，实现了鲎血细胞膜组织的充分利用。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的鲎血血细胞蛋白活性肽。

一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：

1.一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：

s1：将鲎血细胞置于冷冻管，按已设定程序的可程序降温机中每分钟降1℃～3℃至低温-15℃～-20℃间，冷冻11h～13h，然后至0℃～4℃解冻，完全融化，如此反复冻融三次；

s2：温度保持在0℃～4℃间，将s1所得鲎血血细胞磁力搅拌8min～13min，致鲎血细胞完全破裂；

s3：温度保持在0℃～4℃间，将s2所得破裂鲎血血细胞进行低温离心处理，速率3500rpm～4500rpm，15min～25min，然后收集固体沉淀，用蒸馏水冲洗3～5次，至得到鲎血细胞膜组织；

s4：用酶活3800u/g～4200u/g的胰酶粉酶解s3所得鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph7.0，60℃～80℃，酶浓度1.8mg/ml～2.4mg/ml，底物浓度2.0mg/ml～6.0mg/ml，酶解4h～6h；

s5：将s4所得酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在0℃～4℃间，速率3500rpm～4500rpm离心分离15min～25min，得到上清液；

s6：温度保持在-50℃，将s5所得上清液冷冻至干燥完全为止，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。

优先地，步骤s1的冷冻温度为-18℃，融化温度为4℃。

优先地，步骤s2的温度保持在4℃，磁力搅拌10min。

优先地，步骤s3的温度保持在4℃，离心速率4000rpm，20min。

优先地，步骤s4的胰酶粉，酶活为4000u/g，酶解条件，ph7.0，温度70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

优先地，步骤s5的离心分离，温度4℃，4000rpm，20min。

上述制备方法得到的鲎血血细胞蛋白活性肽，能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，可用于阿尔茨海默病人的治疗和保健，当浓度为0.12mg/ml时，羟自由基的清除率达到97.3%，和0.05mg/ml维生素c的清除率为97.1%相当；当浓度为0.20mg/ml时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0%；肽得率36.50%。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明制备方法工艺简单，易于操作，具有较大的推广应用价值。

2、本发明用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶种单一不复杂，且只需在一定的ph、温度和溶度条件下，将酶液与样品混合，操作条件温和，步骤不繁琐，生产效率高，易于大规模生产。

3、本发明是一种生物蛋白活性肽，易吸收，无副作用，能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，可用于阿尔茨海默病人的治疗和保健，当浓度为0.12mg/ml时，羟自由基的清除率达到97.3%和0.05mg/ml维生素c的清除率为97.1%相当；当浓度为0.20mg/ml时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0%；肽得率36.50%；不仅能有效抑制乙酰胆碱酯酶还可以清除羟自由基，还可作为阿尔茨海默病的药物和保健品。

附图说明

图1对实施例1~6进行统计，得出不同条件下各肽得率、对乙酰胆碱酯酶抑制率、对羟自由基的清除率的数据的示意图，其中“--”表明没有测试数据。

图2对实施例1~6进行统计，得出实施后各元素含量示意图。

具体实施方式

实施例一

1.鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻12h，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4000rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用酶活为4000u/g的胰酶粉酶解上述得到的鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph7.0，70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4000rpm低温离心20min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。

7.鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12mg/ml时，羟自由基的清除率达到97.3%，和0.05mg/ml维生素c的清除率（97.1%）相当；当浓度为0.20mg/ml时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0%；肽得率36.50%。

实施例二

1.鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻11h，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4500rpm低温离心18min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用木瓜蛋白酶酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph7.0，70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4500rpm/min低温离心18min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。

7.鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12mg/ml时，羟自由基的清除率达到2.4%；当浓度为0.20mg/ml时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到21.7%；肽得率8.17%。

实施例三

1.鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率3800rpm低温离心25min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用胰蛋白酶酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph7.0，70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率3800rpm低温离心25min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。

7.鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12mg/ml时，羟自由基的清除率达到0.5%；当浓度为0.20mg/ml时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到14.6%；肽得率7.67%。

实施例四

1.鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4000rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph6.5，70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4000rpm低温离心20min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率17.25%。

实施例五

1.鲎血血细胞置于低温-20℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌8min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4200rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph8.0，70℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4200rpm低温离心20min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率13.67%。

实施例六

1.鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。

2.温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌12min，致鲎血细胞破裂。

3.温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4500rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。

4.用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：ph6.5，75℃，酶浓度2.2mg/ml，底物浓度4.0mg/ml，酶解5h。

5.将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4500rpm低温离心20min，得到上清液。

6.温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率17.38%。