利用交联酶聚集体固定化方法制备马拉硫磷水解酶与流程

本发明涉及有机磷酶固定化方法的开发和制备，具体涉及一种新型交联聚集体固定化酶的制备方法及其应用。

背景技术：

有机磷酸酯类物质是人工合成的一类高毒化合物，包括磷酸酯类、磷酸硫醇酯类等多种类型，广泛应用于农药杀虫剂、除草剂等，其中马拉硫磷在世界上多个国家广泛用于防治粮食、蔬菜、烟草、茶等农作物上的抗病虫害。由于自然进化的生物催化体系对这种人工合成的化合物降解能力有限，因此有机磷化合物对环境安全和人类健康造成了很大的威胁。

有机磷水解酶通过水解有机磷化合物的磷酯键，降低其毒性，可应用于洗涤剂、解毒药剂、土壤修复剂以及有害农药或神经毒剂的清除剂，在生物脱毒领域具有广泛的应用，是一种可靠的生物修复和解毒的方法。但目前报道的有机磷水解酶受制于低催化效率、低热稳定性或低表达量，能够满足应用需求的有机磷水解酶及其突变体仍然较少。同时，游离状态的酶具有水溶性，使用后不能回收利用，且易受到高温、有机溶剂等影响失活，不具有很好的储存稳定性和操作稳定性。因此，这些缺陷限制了游离酶的应用。

上述有机磷水解酶的缺陷可以通过制备固定化酶来克服。经固定化后，固定化酶具有比游离酶更多的优点：固定化酶与底物、产物较易分离，反应结束后经离心或过滤等简单的操作就可回收固定化酶，且酶活力降低较少，可重复多批次使用，减少了生产成本经固定化处理后，一般稳定性、热稳定性等会有较大提高，对抑制剂的敏感性下降。固定化酶适用于自动化、连续化生产，易控制催化过程，而且不会将酶蛋白带进产品中导致酶的残留，简化后期提纯工艺，提高了酶的利用效率。但固定化酶也存在一定缺陷：(1)降低了酶与底物的传质效率；(2)酶的构象发生改变，降低酶的活力；(3)固定化和使用的过程中会造成酶的损失。因此，需要针对不同的使用需求，选择适合的固定化方式，并且对酶固定化过程中的载体、ph、基质的浓度、酶的上载量、制备时间等参数进行优化，从而得到制备方法简单、费用低廉、活力损失少、稳定性高的固定化酶。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用交联酶聚集体固定化方法制备马拉硫磷水解酶。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种利用交联酶聚集体固定化方法制备马拉硫磷水解酶，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)往马拉硫磷水解酶溶液中加入一定量的硫酸铵并搅拌均匀，通过盐析得到马拉硫磷水解酶的聚集体；

(2)将一定浓度的聚醚加入上述聚集体中，得到聚集体和聚醚的结合物；

(3)最后加入一定浓度的戊二醛进行交联反应，结束后离心或过滤得到的不溶性颗粒即为固定化酶。

步骤1所述的马拉硫磷水解酶的来源包括但不限于pseudomonasoleovoransdsm50188。(购买自leibnizinstitutedsmz-germancollectionofmicroorganismsandcellcultures,购买链接：https://www.dsmz.de/catalogues/catalogue-microorganisms.html#searchresult)

进一步地，步骤1所述的马拉硫磷水解酶的浓度是10-40mg/ml，优选20mg/ml。

进一步地，步骤1中，加入硫酸铵使得溶液中的硫酸铵终浓度为0.2-0.8g/ml，优选0.3-0.7g/ml，进一步优选0.5g/ml；盐析温度为0-10℃，盐析时间为15-60min，优选盐析温度为4℃，盐析时间为30min。

进一步地，步骤2中的聚醚平均分子量为8000-15000，加量为马拉硫磷水解酶质量的0.1-1.5倍，反应温度为0-10℃，反应时间为15-60min。聚醚为市售聚醚，包括聚醚pluronicf127，聚醚与马拉硫磷水解酶的质量比为1:0-1:6，优选1:4，交联聚集体与聚醚反应条件优选为4℃搅拌30min。

进一步地，步骤3中的戊二醛的终浓度为30-120mm，优选90mm，交联反应温度为0-10℃，反应时间为1-5小时，优选交联反应温度为4℃，反应时间为3小时。

进一步地，步骤3所述的离心的分离条件为12000rpm时间3min。

进一步地，所得固定化酶用于工业洗涤、污染土壤、水体的修复上降解马拉硫磷。

本发明提供了采用上述方法制备而成的新型交联聚集体固定化酶。

上述新型交联聚集体固定化酶在马拉硫磷解毒中的用途。

与现有技术相比，本发明提供了一种新型交联聚集体固定化酶的制备方法，采用该方法制备的新型交联聚集体固定化酶的固定化率较高，共固定化酶的酶活力、操作稳定性和洗涤剂耐受性均较好。马拉硫磷水解酶的活力提高了4倍，稳定性和洗涤剂耐受性都明显提高，并且重复回收使用10次酶活力基本不变，表现出了非常好的活力和稳定性。在实际降解马拉硫磷试验中，该固定化酶在高温条件下表现出良好的降解效果，在50℃时15min内可将0.15mm的马拉硫磷完全水解酶，在室温下30min内可将0.15mm的马拉硫磷完全降解，能满足工业洗涤中马拉硫磷的去除需求，甚至在其他生物解毒领域如被污染土壤、水体的修复上可以有良好的应用。

附图说明

图1为本发明实施例中传统固定化方法和新型交联聚集体固定化方法的效果对照图(clea:酶+硫酸铵沉淀+戊二醛交联,1:酶+聚醚+硫酸铵+戊二醛，2：本发明实施例中的添加顺序，酶+硫酸铵+聚醚+戊二醛，3：酶+硫酸铵+戊二醛+聚醚)。

图2为本发明实施例中硫酸铵浓度对固定化酶活力的影响图；

图3为本发明实施例中酶浓度对固定化酶活力的影响图；

图4为本发明实施例中聚醚浓度对固定化酶活力的影响图；

图5为本发明实施例中戊二醛浓度对固定化酶活力的影响图；

图6为本发明实施例中固定化酶的最适ph；

图7为本发明实施例中固定化酶的最适温度；

图9为本发明实施例新型固定化酶clea-pl127(a)和游离酶(b)分别在洗涤剂中孵育120min残余酶活；

图8为本发明实施例中游离酶、常规固定化酶、本方案固定化酶在50℃中孵育残余酶活；

图10为本发明实施例中固定化酶重复操作10次过程中的操作稳定性；

图11为本发明实施例中固定化酶在0.1％洗涤剂溶液分别在室温(a)和50℃(b)下有机磷降解率。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。但是应该指出的是本发明的实施不限于以下介绍的实施方法。

实施例1

有机磷水解酶(即马拉硫磷水解酶pseudomonasoleovoransdsm50188)溶解在1ml50mm磷酸盐缓冲溶液(ph7.0)缓冲液中，马拉硫磷水解酶浓度是20mg/ml，先加入硫酸铵进行聚集体沉淀，4℃条件下搅拌30min，硫酸铵的加入量为使得溶液中的硫酸铵终浓度为0.4g/ml；再加入聚醚pluronicf127，聚醚pluronicf127与马拉硫磷水解酶的质量比为1:4，在4℃条件下搅拌30min；最后加入戊二醛，戊二醛浓度90mm，4℃条件下交联3h。反应结束后收集反应液12000rpm离心3min分离固定化酶。

酶活力测定：

将固定化酶置于50℃恒温振荡反应器上保温7h。每孵育一定时间取一定量的固定化酶加入到含有终浓度为0.5mm马拉硫磷的1ml50mmtris-hcl(ph9.0，含2mmellman试剂)缓冲溶液中，分别测定反应液反应1min的吸光度变化率。以不加固定化酶作为空白对照，通过分光光度法测量7h内酶的活力变化。结果表明50℃孵育到7h固定化酶的残余活力在65％以上，明显优于常规方法制备的固定化酶和游离酶，对高温的适应能力非常强，完全可以用于较高温度环境中马拉硫磷的降解。

固定化酶的活力和稳定性的测试：

将固定化酶分别加入含有0.1％的商业洗涤剂的50mmtris-hcl缓冲液(ph9.0，含2mmellman试剂)中，孵育120min，每隔20min测一次酶活。实验结果表明固定化酶的活力和稳定性都大大优于游离酶，并且无论是不含洗涤剂还是含洗涤剂情况下都有着相当卓越的表现，在孵育开始后，酶活力均一路走高，到120min孵育结束时，酶活力上升到了初始活力的2倍。而对于游离酶，从孵育开始酶活力一直走低，其中sds和apg对游离酶的影响最严重，60min后70％的酶活力丧失，即使在影响最小的cod溶液中孵育60min，游离酶的活力也丧失了30％。

固定化酶的操作稳定性：

取适量固定化酶加入990μl的50mmtris-hcl缓冲液(ph9.0，含2mmellman试剂)中，加入10μl50mm的马拉硫磷，振荡混匀后，在分光光度计上反应1min后测412nm处吸光度值，计算该批次水解反应初速度。继续反应10min后，12000rpm离心3min收集固定化酶，缓冲液洗涤3次后，进行下一批次的反应，重复操作10次。固定化酶表现出很好重复使用稳定性，重复使用10批次后，活力仍然保持在86％左右。

0.1％洗涤剂中固定化酶降解马拉硫磷实验

将一定量的固定化酶分别加入到三种不同0.1％浓度的商业洗涤剂(cod、apg、sds)中，分别以0.15mm的马拉硫磷作为底物进行反应，在分光光度计中反应30min每1min记录一次吸光度值。实验结果表明在室温下固定化酶在无洗涤剂和0.1％cod的溶液中反应30min后可以将马拉硫磷水解完全，而等量的固定化酶在50℃的无洗涤剂和0.1％cod溶液中反应15min就能将同样浓度的马拉硫磷完全水解。

实施例2

一种利用交联酶聚集体固定化方法制备马拉硫磷水解酶，该方法包括以下步骤：

(1)往马拉硫磷水解酶溶液中加入一定量的硫酸铵并搅拌均匀，通过盐析得到马拉硫磷水解酶的聚集体；

(2)将一定浓度的聚醚加入上述聚集体中，得到聚集体和聚醚的结合物；

(3)最后加入一定浓度的戊二醛进行交联反应，结束后离心或过滤得到的不溶性颗粒即为固定化酶。

图1为传统固定化方法和新型交联聚集体固定化方法的效果对照图，说明了所有添加聚醚pluronicf127后的交联方法比活力均高于常规的clea，其中最佳的添加方式为：poophm9与硫酸铵沉淀形成聚集体，加入聚醚pl127，最后与戊二醛交联，该固定化方法的酶比活力是常规clea的5倍，这种方法即为本发明实施例中的新型固定化方法。

图2为加入不同浓度的硫酸铵对最终固定化酶的酶活力影响图，从图中可以看出，当硫酸铵的浓度0.2-0.8g/ml时检测到有酶活，当硫酸铵的浓度0.5g/ml时酶活达到最高；

图3为酶浓度对固定化酶活力的影响图；即马拉硫磷水解酶pseudomonasoleovoransdsm50188的浓度不同对固定化酶活力的影响，从图中可以看出，马拉硫磷水解酶的浓度为10-40mg/ml时，均有较好的酶活。

图4为聚醚浓度对固定化酶活力的影响图；从图中可以看出，当聚醚与马拉硫磷水解酶的质量比为1:0-1:6，均有酶活，其比例为1:4时，酶活最好。

图5为戊二醛浓度对固定化酶活力的影响图，从图中可以看出，戊二醛的终浓度为30-120mm时，均有酶活，其浓度为90mm时，酶活最好。

图6为固定化酶的最适ph，从图中可以看出，其中ph为8-10时，均匀较好的反应活性，当ph为9时，反应活性最好。本发明实施例中新型固定化酶与游离酶相比较没有发生明显改变，但ph范围变宽，在ph8.0-11.0范围内clea-pl127的活力始终维持在80％以上。

图7为温度的不同对固定化酶的反应活性影响图，从图中可以看出，本发明实施例中新型固定化酶与游离酶相比较，最适温度由30℃升高到了50℃，并且在40-60℃中活力保持在80％以上，即使是在80℃高温下仍然保持了27％的活性，而此时的游离酶已经完全失活。

图8为游离酶、常规固定化酶、本方案固定化酶在50℃中孵育残余酶活，从图中可以看出，本发明实施例中新型固定化酶clea-pl12750℃孵育7h，残余活力保持在65％以上，而常规固定化酶clea在孵育到7h活力已经丧失了50％。游离酶在50℃下孵育1h活力迅速的下降。这表明，本发明实施例中的新型固定化酶有更好的高温耐受性。图9为本发明实施例新型固定化酶clea-pl127(a)和游离酶(b)分别在洗涤剂中孵育120min残余酶活，从图中可以看出，本发明实施例中新型固定化酶在洗涤剂中和不加洗涤剂情况下孵育120min，酶活力上升到了初始活力的2倍左右。而游离酶，从孵育开始酶活力一直走低，表明本发明实施例中新型固定化酶在洗涤剂中的稳定性大大高于游离酶。

图10为固定化酶重复操作10次过程中的操作稳定性，从图中可以看出，本发明实施例中新型固定化酶clea-pl127表现出很好重复使用稳定性，重复使用10批次后，活力仍然保持在86％左右。

图11固定化酶在0.1％洗涤剂溶液分别在室温(a)和50℃(b)下有机磷降解率，从图中可以看出，本发明实施例中的新型固定化酶在50℃高温条件下降解效果更好。