一种具有降尿酸活性的海洋低聚肽的制备方法与流程

本发明属于水产品精深加工技术领域，尤其涉及一种对小鼠高尿酸血症具有良好拮抗作用的鲣鱼低聚肽的制备方法。

背景技术

鲣鱼，通常被称为炸弹鱼，类属硬骨鱼纲、鲭科、鲈形总目。鲣鱼的储量极其丰富，且鱼肉属红色肉，肉质鲜美滑嫩。此外，其鱼肉膳食营养价值极高，不但其所含蛋白质相当丰富，氨基酸种类也较为多样且比例合理。

高尿酸血症是在正常嘌呤饮食情况下不同天的两次空腹检测血尿酸水平，是痛风的发病基础，也是导致高血压、高血脂、冠心病、代谢综合症、肾脏损伤等疾病发生的因素。作为一种发病率高、危害性大的疾病，高尿酸血症正逐渐引起人们的重视。目前，临床治疗高尿酸血症主要采用别嘌呤醇、苯溴马隆、丙磺舒等药物。别嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来减少尿酸生成、降低血尿酸浓度，其副作用主要表现为肾脏毒性、皮疹及肝功能障碍；苯溴马隆、丙磺舒等药物通过促进肾脏对尿酸的排泄来达到降低体内尿酸含量的目的，对肝、肾功能有一定的损伤。因此开发经济、安全、无毒无副作用的防治高尿酸血症的药物具有重大的研究意义。

海洋鱼低聚肽具有多种功效，如降低血压、降低胆固醇和增强免疫力等。而鲣鱼属于低脂高蛋白海产品，营养价值丰富，但目前对于具有降尿酸活性的鲣鱼低聚肽制备工艺的优化及其生物活性功能研究未见报道。综上，开发一种高效、简单的海洋低聚肽的制备方法，旨在为预防高尿酸血症药物的研发提供理论依据和技术指导。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有降尿酸活性的海洋低聚肽的制备方法，该方法通过对鱼糜酶解过程进行优化，构建出最优的酶解方法，利用该方法制备的鲣鱼低聚肽产品在制备防治高尿酸血症药物中具有重要应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有降尿酸活性的海洋低聚肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）原料预处理：将鲣鱼洗净后去内脏、鱼头、鱼尾，鱼肉经高速组织匀浆机绞碎、拌匀后冷冻备用；

（2）酶解：在步骤（1）所获得的鱼糜中添加4400u/g的风味蛋白酶，按料液比1:1的比例加入ro水，42℃水浴6.5h后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液；

（3）冻干：将步骤（2）中所获得的鲣鱼蛋白酶解液置于真空冷冻干燥机里冻干，即获得低聚肽粉末。

所述方法制备得到的鲣鱼低聚肽。

所述制得的鲣鱼低聚肽在制备预防高尿酸血症药物中的应用。

与现有研究相比，本发明具有的有益效果是：本发明利用鲣鱼作为主要原料，原料本身具有极高的营养价值，不但其所含蛋白质相当丰富，氨基酸种类也较为多样且比例合理。其次，本发明利用鲣鱼制备低聚肽的方法简便，制备工艺简单易操作，有利于产业化应用，制得的低聚肽得率高，采用响应面法优化确定最优酶解参数，保证了工艺的科学性。此外，利用该方法制备的鲣鱼低聚肽经小鼠模型验证，具有显著的降高尿酸血症的功效，能减少药物治疗的毒副作用及治疗成本，在制备预防高尿酸血症药物中具有应用价值。

附图说明

图15种蛋白酶酶解效果比较。

图2料液比对鲣鱼低聚肽得率的影响。

图3加酶量对鲣鱼低聚肽得率的影响。

图4酶解时间对鲣鱼低聚肽得率的影响。

图5酶解温度对鲣鱼低聚肽得率的影响。

图6-a加酶量与酶解时间交互作用。

图6-b加酶量与酶解温度交互作用。

图6-c酶解时间与酶解温度交互作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

1.鲣鱼原料预处理：鲣鱼洗净→去内脏、鱼头、鱼尾→采肉→经高速组织匀浆机绞碎、拌匀→冷冻备用。

2.鲣鱼低聚肽得率计算：

其中，酸溶蛋白质水解物含量：参照gb/t22729-2008的方法进行测定。取5ml鲣鱼蛋白酶解液，加入5ml15%三氯乙酸，混匀后静置10min，8000r/min，4℃离心10min，取上清液即为待测液。称取3g待测液放在消化管中，于消化炉里去除水分，冷却后加入1片foss片和15ml浓硫酸，消化，冷却，用kjeltec8400全自动定氮仪测定酸溶蛋白质水解物含量，以mgn/g为单位。

氨基酸态氮含量：参照gb5009.235-2016进行测定。取1ml鲣鱼蛋白酶解液，加入1mlro水、4ml乙酸钠-乙酸缓冲溶液、4ml显色剂（15ml37%甲醇与7.8ml乙酰丙酮混合，加水稀释至100ml），混匀，在100℃加热15min，冷却，于400nm处测定吸光值。氨氮标准曲线：y=0.01x-0.004（r2=0.998），其中y为400nm处的吸光值；x为测定液中氮的质量，以μgn为单位，计算公式如下：

式中：x为测定液中氮的质量，以μgn为单位；

v为提取鲣鱼蛋白酶解液中加入ro水的体积，以ml为单位；

m为提取鲣鱼蛋白酶解液中鲣鱼鱼糜的质量，以g为单位。

鲣鱼蛋白含量：参照gb5009.5-2016进行测定。取1g鲣鱼鱼糜放在消化管中，于消化炉里去除水分，冷却后加入1片foss片和15ml浓硫酸，消化，冷却，用kjeltec8400全自动定氮仪测定鲣鱼蛋白含量，以mgn/g为单位。

根据上述方法进行单因素试验

（1）酶筛选：选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶5种蛋白酶【木瓜蛋白酶（x1=800000u/g）、中性蛋白酶（x2=50000u/g）、风味味蛋白酶（x3=20000u/g）、碱性蛋白酶（x4=50000u/g）、酸性蛋白酶（x5=50000u/g）】，以鲣鱼低聚肽得率为评价指标，每克鱼糜中加入2000u的蛋白酶，探讨最适合酶解鲣鱼的酶种类。酶解结束后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液。5种蛋白酶酶解参数见表1。

表15种蛋白酶酶解参数

结果如图1所示，在五种蛋白酶中，风味蛋白酶酶解鲣鱼鱼糜的效果最佳，其得到的低聚肽得率最高，为17.000%；中性蛋白酶酶解鲣鱼鱼糜的效果次之，低聚肽得率为15.155%；而木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶酶解鲣鱼鱼糜的效果略差。因此选用风味蛋白酶为最佳酶用以制备鲣鱼低聚肽。

（2）料液比单因素试验：精确称取50g鲣鱼鱼糜10份，每克鱼糜中各加入2000u的蛋白酶，在自然ph下按照料液比分别为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3加入ro水，50℃酶解5h后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液。结果如图2所示，随着料液比的增加，鲣鱼低聚肽得率降低，即料液比为1:1时，低聚肽得率达到最大。这说明料液比达到一定水平时，底物和酶已达到完全饱和的状态，继续增加料液比，导致酶解液中其它杂质的含量增加，鲣鱼低聚肽的得率反而下降，影响酶解效果。统计分析表明，料液比为1:1时的鲣鱼低聚肽得率显著（p<0.05）高于料液比为1:1.5~1:3时的低聚肽得率。因此，为了显著提高鲣鱼低聚肽的得率，优化试验时固定料液比为1:1。

（3）加酶量单因素试验：精确称取50g鲣鱼鱼糜10份，各加入ro水100ml，在自然ph下按照每克鱼糜中分别加入1000、2000、3000、4000、5000u的蛋白酶，50℃水浴5h后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液。结果如图3所示，随着酶用量的增加，鲣鱼低聚肽得率呈逐渐上升后逐渐下降的趋势。因加酶量不同所以其变化幅度也各有差异。因此，鲣鱼低聚肽得率及优化工艺时，选取加酶量的变量范围为（4000±400）u/g。

（4）酶解时间单因素试验：精确称取50g鲣鱼鱼糜10份，每克鱼糜中各加入2000u的蛋白酶和100ml的ro水，在自然ph下分别于50℃水浴3、4、5、6、7h后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液。结果如图4所示，酶解时间对鲣鱼低聚肽得率有较大影响，酶解5~6h时，低聚肽得率快速上升，当酶解时间达到6h时，此时低聚肽得率的值最高，因此，鲣鱼低聚肽得率及优化工艺时，选取酶解时间的变量范围为（6±0.5）h。

（5）酶解温度：精确称取50g鲣鱼鱼糜10份，每克鱼糜中各加入2000u的蛋白酶和100ml的ro水，在自然ph下分别在30、40、50、60、70℃水浴5h后于95~100℃加热10min钝化灭酶，10000r/min，4℃离心20min，取上清液即为鲣鱼蛋白酶解液。结果如图5所示，低聚肽得率随着酶解温度的升高而逐渐增加，当温度达到40℃时，低聚肽得率达到最大值，因此，鲣鱼低聚肽得率及优化工艺时，选取酶解温度的变量范围为（40±5）℃。

根据单因素试验确定因素和水平见表2。

表2响应面试验设计因素及水平

3.响应面试验设计

综合单因素试验及分析结果，响应面法优化鲣鱼低聚肽的酶解工艺时，在固定料液比为1:1的基础上，采用加酶量、酶解时间和酶解温度为关键工艺参数，设计3因素3水平，通过box-behnken原理进行响应面优化试验，并以鲣鱼鱼糜低聚肽得率为参照指标，设计17个不同组合的试验，采用designexpert8.0.6分析软件对试验因子进行编码组合，响应面设计及结果如下所示：

（1）box-behnken试验设计及结果

根据单因素试验及分析结果所设计的3因素3水平box-behnken响应面优化试验，在17个试验组合条件下所得到的试验设计方案及数据处理结果如表3所示。

表3响应面试验设计方案

（2）回归方程方差分析

根据box-behnken试验设计要求，对上述17组试验数据进行二次多元回归拟合，获得项目指标（r1低聚肽得率）对影响因子（a加酶量、b酶解时间和c酶解温度）的关系为：

r1低聚肽得率=+30.96+1.66a+0.047b-0.90c+0.77ab+1.17ac+0.45bc-0.25a²+0.32b²

-0.88c²

为检验该二次多元回归方程的有效性，进一步对响应面法优化鲣鱼低聚肽得率的显著性和多元回归模型的方差进行分析，其分析结果见表4。由表4可知，二次多元回归方程模型p值为0.0004<0.01，表明该模型高度显著，而模型的失拟性p值为0.1083>0.05为不显著，进一步说明模型与实际情况拟合情况良好，可以使用该模型对实际试验进行预测和分析。响应值r1的决定系数r²=0.9610，说明响应值与回归方程的拟合程度很好，表明鲣鱼鱼糜低聚肽得率试验值与预测值具有较高的一致性；模型的校正决定系数radj²=0.9109，表明该模型能解释91.09%响应值变化，仅有8.91%不能用该模型来解释。因此，该模型能够较好的优化鲣鱼低聚肽的酶解工艺。

表4响应面法优化鲣鱼低聚肽得率的方差分析

注：当p<0.01时高度显著，标记为**；当p<0.05时显著，标记为*；当p>0.05时不显著，标记为-。

（3）响应曲面分析

响应曲面图是响应值对各试验因素a、b和c所构成的三维图形，从响应曲面图中能够形象直观地看出最佳参数和各参数之间的相互关系。若响应面图的曲面坡度平缓，则表明两影响因子交互作用小；若响应面图的曲面坡度陡峭，则表示两影响因子交互作用大。

从图3中能够看出加酶量、酶解时间、酶解温度这三个因素之间的交互作用对低聚肽得率的影响。在图6-a中，响应曲面图坡度稍陡，说明加酶量和酶解时间的交互作用相对显著；在图6-b中，响应曲面图坡度较陡，说明加酶量和酶解时间的交互关系较为显著；在图6-c中，响应曲面图坡度较为平缓，说明酶解时间和酶解温度的交互关系不是特别显著。从响应曲面图中直观得出的结果与方差分析中的结果一致。

4.验证试验

通过designexpert8.0.6软件进行分析，由二次多项回归方程来预测最佳的工艺参数条件，即加酶量4400u/g，酶解时间为6.5h，酶解温度42.07℃。该条件下鲣鱼鱼糜酶解液的低聚肽得率预测值为33.648%。考虑到操作的可行性，将最佳的工艺参数条件调整为加酶量4400u/g，酶解时间为6.5h，酶解温度42℃。采取所得的最佳工艺参数进行实验，经过三次平行实验取平均值后得到鲣鱼酶解液的低聚肽得率为33.166%，此实验结果与理论推测的结果相差不大，说明优化结果可靠。因此认为，本试验所建立的数学模型可准确预测鲣鱼鱼糜的低聚肽得率。

实施例2

将96只icr小鼠适应性喂养7天后，随机平均分为六组，每组16只，分别为正常组，模型组，阳性对照组（别嘌呤醇组），鲣鱼酶解产物低剂量组（200mg/kg）、中剂量组（600mg/kg）、高剂量组（1000mg/kg），连续7天按表5所示对各组给药处理，于给药第六天禁食过夜，第七天腹腔注射一小时后眼球取血，血液静置半小时后，于4℃3000rpm/min条件下离心10min，取上清即血清，4℃保存待测。迅速在冰台上取出肝脏，投入液氮中速冻后，转移至-80℃保存备用。

表5动物的分组和给药处理

1.样品对高尿酸血症小鼠体重水平的影响

由表6可知，氧嗪酸钾盐造模前后，小鼠体重无明显变化（p＞0.05），验证了用氧嗪酸钾盐造模对小鼠无明显毒副作用；各组小鼠的体重基本保持稳定略有升高，说明鲣鱼低聚肽治疗期间对小鼠的身体没有明显的影响，可初步判断其无明显毒副作用。

表6鲣鱼低聚肽对高尿酸小鼠体重水平的影响

2.样品对高尿酸血症小鼠血清尿酸（ua）水平的影响

由表7可知，与正常组相比较，模型组的尿酸水平极显著（p＜0.01）高于正常组，说明造模成功。与模型组相比较，阳性对照组（别嘌呤醇组）极显著（p＜0.01）降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，但与正常组小鼠血清尿酸水平差异没有统计学意义（p＞0.05）。鲣鱼低聚肽低剂量组与模型组的血清尿酸水平差异没有统计学意义（p＞0.05），但显著（p＜0.05）高于正常组的血清尿酸水平，说明低剂量组没有降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠尿酸水平的作用；但中、高剂量组的血清尿酸水平极显著（p＜0.01）低于模型组，且中、高剂量组的血清尿酸水平与正常组的血清尿酸水平均没有统计学意义（p＞0.05），可见中剂量组和高剂量组均能降低氧嗪酸钾诱导所致的高尿酸小鼠的血清尿酸水平，并能接近正常小鼠的尿酸水平。

表7鲣鱼低聚肽对高尿酸小鼠血清尿酸水平的影响

注：与正常组比，##表示p＜0.01；与模型组比，**表示p＜0.01。

3.样品对高尿酸血症小鼠血清尿素氮（bun）水平的影响

由表8可知，与正常组相比，模型组bun含量极显著（p＜0.01）升高；与模型组相比，阳性对照组（别嘌呤醇组）以及鲣鱼低聚肽低、中、高剂量组bun含量均极显著（p＜0.01）降低；进一步比较发现，阳性对照组（别嘌呤醇组）bun含量极显著（p＜0.01）高于鲣鱼低聚肽低、高剂量组，显著（p＜0.05）高于中剂量组，说明鲣鱼低聚肽对肾脏有较好的保护作用。

表8鲣鱼低聚肽对高尿酸小鼠血清尿素氮水平的影响

注：与正常组比，##表示p＜0.01；与模型组比，**表示p＜0.01；与别嘌呤醇组比，δ表示p＜0.05，δδ表示p＜0.01。

4.样品对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶（xod）水平的影响

由表9可知，与正常组相比较，模型组黄嘌呤氧化酶的活性极显著（p＜0.01）高于正常组；与模型组相比较，阳性对照组（别嘌呤醇组）以及鲣鱼低聚肽低、中、高剂量组的黄嘌呤氧化酶活性极显著（p＜0.01）低于模型组，说明别嘌呤醇、鲣鱼低聚肽低中高剂量都可以降低小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性。

表9鲣鱼低聚肽对高尿酸小鼠黄嘌呤氧化酶活性水平的影响

注：与正常组比，##表示p＜0.01；与模型组比，**表示p＜0.01。

5.样品对高尿酸血症小鼠肝脏腺苷脱氨酶（ada）水平的影响

由表10可知，与正常组相比，模型组的腺苷脱氨酶活性极显著（p＜0.01）升高；与模型组相比，阳性对照组（别嘌呤醇组）以及低、中、高剂量组的腺苷脱氨酶活性极显著（p＜0.01）降低，说明别嘌呤醇以及鲣鱼低聚肽低、中、高剂量均显著降低腺苷脱氨酶活性，且与正常组的ada活性没有统计学意义（p＞0.05）。

表10鲣鱼低聚肽对高尿酸小鼠肝脏腺苷脱氨酶活性水平的影响

注：与正常组比，##表示p＜0.01；与模型组比，**表示p＜0.01。

鲣鱼低聚肽的低、中、高剂量组均能极显著（p＜0.01）降低小鼠血清尿素氮含量、腺苷脱氨酶和黄嘌呤氧化酶的活性；且低剂量组的尿酸水平与模型组相比没有统计学意义，但中、高剂量组都能极显著（p＜0.01）降低尿酸水平，判断鲣鱼低聚肽降尿酸作用除了通过抑制黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶的活性从而降低血清尿酸水平，还存在其他降尿酸途径，鲣鱼低聚肽的中、高剂量组对氧嗪酸钾所致的高尿酸血症小鼠有一定的降尿酸效果。通过小鼠体重变化，血清尿素氮含量判断鲣鱼低聚肽无明显毒副作用。综上所述，鲣鱼低聚肽能够降低高尿酸血症模型小鼠的血尿酸，改善高尿酸血症小鼠肾脏功能，且无明显毒副作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。