微环DNA表达抗HPV治疗性工程抗体及其应用的制作方法

文档序号：16208053发布日期：2018-12-08 07:22阅读：520来源：国知局

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微环(minicircle,mc)dna载体，更具体为一种用于在体内表达抗hpv(人乳头瘤病毒)双特异性抗体的微环dna载体。

背景技术

人乳头瘤病毒(hpv)属于人类高致病性病毒，传播非常广泛，能够引起人类皮肤和黏膜的多种良性乳头状瘤，也可以引起宫颈病变。hpv病毒是导致宫颈癌的直接病因和主要原因。已知的hpv病毒有100多种，主要分为高危型和低危型。高危型包括16、18、45、58等15种型别，其中hpv16和18型是致癌性最强的型别。宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，全球每年出现约55万新发宫颈癌病例，有20多万人死于宫颈癌。我国的形势同样严峻，每年约有13万新增患者。hpv病毒除了引发宫颈癌之外，还会导致皮肤疣、生殖器疣。此外，hpv病毒并不只针对女性，男性也可以感染hpv病毒，导致男性的肛门癌、阴茎癌和口腔癌等。宫颈癌属于极少数病因和机理明确、可通过早期检查能够预防和治愈的癌症。目前，预防宫颈癌的手段主要是宫颈癌的早期筛查和免疫接种宫颈癌疫苗(hpv疫苗)。

hpv病毒上的蛋白主要包括晚期蛋白l1(主要衣壳蛋白)、晚期蛋白l2(次要衣壳蛋白)、早期蛋白e1、e2、e4、e5、e6和e7。由l1、l2蛋白出发制备的宫颈癌疫苗属于预防性疫苗。高危型hpv的e6、e7蛋白是主要的转化蛋白，与hpv致癌作用密切相关。由e6、e7蛋白出发制备的宫颈癌疫苗属于治疗性疫苗。目前已经上市的宫颈癌疫苗包括默沙东的4价疫苗gardasil和葛兰素史克的2价疫苗cervarix，均属于预防性疫苗。2017年7月，国内首个宫颈癌疫苗，葛兰素史克的“希瑞适”上市，该疫苗适用于9-25岁的女性。

对于预防和治疗hpv感染及hpv相关癌症，可采用与hpv病毒特异性结合的双特异性抗体。双特异性抗体介导效应细胞(t细胞或nk细胞)杀灭hpv感染细胞或hpv整合癌细胞。制备双特异性抗体可以采用基因工程的手段。微环(minicircle，mc)dna载体表达方法属于基因工程制备法。利用微环dna载体可以表达微环双特异性抗体(mc.bsab)。其中，双特异性抗体可以介导效应细胞(t细胞或nk细胞)杀灭hpv阳性细胞(即hpv感染细胞或hpv相关/整合的癌细胞)。与该发明最接近的技术是我们发明的微环dna载体表达双特异性抗体的技术(mc.bsab，cn201710245146.6)。

技术实现要素：

本发明涉及微环(minicircle，mc)dna载体在体内表达抗人乳头瘤病毒(hpv)工程抗体，用于治疗hpv感染及hpv相关癌症。

本发明提供了一种表达hpv阳性靶细胞与效应细胞桥接器(bridgebetweentargetcell(hpv-positivecell)andeffectorcell，hpv-btec)的重组基因载体，所述桥接器包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分a，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分b。

在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。优选的，所述重组基因载体选自微环dna载体。优选的，所述重组基因载体为重组表达载体，选自原核表达载体或真核表达载体；优选真核表达载体；更优选用于哺乳动物细胞真核表达的重组表达载体。

在一个实施方案中，所述桥接器选自蛋白或多肽。优选的，所述桥接器选自双特异性抗体。优选的，所述部分a和所述部分b分别选自蛋白分子或多肽分子。优选的，所述部分a和部分b分别选自fab、fab’、单链抗体(scfv)、单域抗体(vhh)、单链t细胞受体(sctcr)和其它。

在一个实施方案中，所述靶细胞选自hpv感染细胞、hpv整合癌细胞或其它。所述效应细胞选自t细胞、nk细胞或其它。优选的，所述部分a特异性结合的作用靶点选自：hpv病毒的e6蛋白与mhc-i的复合物，或e7蛋白与mhc-i的复合物；更优选的，所述复合物选自hla-a2/e6或hla-a2/e7。所述部分b特异性结合的作用靶点选自：cd3、cd16、cd28、4-1bb、ox40、tcr、cd56、nkg2d、ncr或其它。

在一个实施方案中，所述部分a选自单链t细胞受体(sctcr)，其包含：β链可变区，其氨基酸序列如seqidno：1所示，和α链可变区，其氨基酸序列如seqidno：3所示；优选的，所述部分b选自单链抗体(scfv)，(1)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如seqidno：5所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如seqidno：7所示；所述部分b特异性结合的作用靶点选自cd3；或者(2)其包含：重链可变区，其氨基酸序列如seqidno：9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如seqidno：11所示；所述部分b特异性结合的作用靶点选自cd16.

在一个实施方案中，所述部分a包含的β链可变区具有与seqidno：1所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的α链可变区与seqidno：3所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述部分b包含的重链可变区具有与seqidno：5或9所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与seqidno：7或11所示序列至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

本发明提供了一种表达hpv阳性靶细胞与效应细胞桥接器的重组基因载体，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：部分a的编码基因，和/或包含部分b的编码基因。优选的，部分a选自单链t细胞受体(sctcr)，其编码基因包含：β链可变区的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：2所示，和/或α链可变区的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：4所示。优选的，部分b选自单链抗体(scfv)，(1)其编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：6所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：8所示；或者(2)其编码基因包含：重链可变区，其氨基酸序列如seqidno：10所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如seqidno：12所示。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述部分a和/或部分b的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接器具有与之前实施方案中所述的桥接器相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含所述桥接器的编码基因，其核苷酸序列如seqidno：13-18中任一项所示。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述桥接器的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接器具有与之前实施方案中所述的桥接器相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。

本发明提供了一种由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接器。优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。更优选的，所述重组基因载体选自微环dna载体。

本发明提供了一种之前实施方案中所述的重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：

(1)从现有技术中分别获取hpv特异性t细胞受体样抗体(抗e6蛋白与mhc-i的复合物或e7蛋白与mhc-i的复合物的tcr，tcr-l)以及cd3抗体、cd16抗体的重链可变区(vh)序列、轻链可变区(vl)序列。

(2)根据上述(1)中vh、vl序列设计成多种组合形式的桥接器，并构建表达所述桥接器的重组基因载体。

任选的，

(3)在体内外鉴定所述桥接器的表达水平，并检测表达产物介导效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体，如标准质粒或其它环状表达盒子。优选的，所述重组基因载体选自微环dna载体。优选的，所述桥接器选自蛋白或多肽。更优选的，所述桥接器选自双特异性抗体。优选的，所述靶细胞选自hpv感染细胞、hpv整合癌细胞或其它。所述效应细胞选自t细胞、nk细胞或其它。

本发明提供了一种宿主细胞，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

本发明提供了一种之前实施方案中所述的桥接器的制备方法，具体步骤包括：

(1)构建所述重组基因载体；

(2)将所述重组基因载体导入宿主细胞；

(3)在适合表达的条件下，培养宿主细胞，诱导表达，分离纯化，获得所述双特异性抗体。

本发明提供了一种药物组合物，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接器，以及药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将重组基因载体或双特异性抗体与药学上可接受的载体混合或用载体稀释。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体。制剂选自片剂、丸剂、粉剂、胶囊、混悬剂、乳剂、溶液剂、气溶胶、注射用溶液等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

本发明提供了之前实施方案中所述的重组基因载体、所述的桥接器、所述的宿主细胞或所述的药物组合物在制备用于hpv感染或hpv相关癌症的药物中的用途。优选的，所述hpv相关癌症选自宫颈癌。

本发明的积极效果包括：

本发明首次公开hpv特异性的hpv阳性靶细胞与效应细胞桥接器(mc.hpv-btec)的微环dna载体设计方案，适用于hpv感染及hpv相关癌症的治疗。当效应细胞的浓度为靶细胞的2.5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用非常微弱。而hpv-btec能够将效应细胞的杀伤作用提高12％左右。当效应细胞的浓度为靶细胞的5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用为15％左右。而hpv-btec能够将效应细胞的杀伤作用再次提高3倍以上。在通常的生理条件下，hpv-btec能够大幅度提高效应细胞对靶细胞的杀伤作用。可见，本发明的hpv-btec、微环dna载体对于预防和治疗hpv感染及hpv相关癌症具有很好的前景，提供了一条新的临床思路。

附图说明

图1：表达抗hpvsctcr/cd3scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图2：表达抗hpvsctcr/cd16scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图3：表达抗hpvsctcr/cd3scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图4：表达抗hpvsctcr/cd16scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图5：表达抗hpvsctcr/cd3scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图6：表达抗hpvsctcr/cd16scfv桥接器hpv-btec的微环dna载体结构图。

图7：hpv-btec介导效应细胞杀伤靶细胞的结果图。e代表效应细胞(cik)；t代表靶细胞(caski)；16e6/cd3-btec代表anti-hpv16-hla-a2/e6/cd3-btec。

具体实施方式

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

实施例1、hpv阳性靶细胞与效应细胞桥接器(hpv-btec)的构建

设计hpv-btec并构建相应的微环dna表达载体，hpv-btec表达框包括多种结构，具体如下：

(1)scfv-scfv结构：

其中，sp为信号肽(signalpeptide)；linker为连接序列。anti-cd3.vh的氨基酸序列如seqidno：5所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：6所示；anti-cd3.vl的氨基酸序列如seqidno：7所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：8所示；anti-cd16.vh的氨基酸序列如seqidno：9所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：10所示；anti-cd16.vl的氨基酸序列如seqidno：11所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：12所示；anti-hpv-tcrl.vh或anti-hpv-tcr.vα的氨基酸序列如seqidno：3所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：4所示；anti-hpv-tcrl.vl或anti-hpv-tcr.vβ的氨基酸序列如seqidno：1所示，编码基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。

(2)dart(dual-affinityre-targetingantibody)结构：

dart表达框经翻译、剪切后形成两条肽链(chain1、chain2)；这两条链通过配对的e/k-coli形成稳定的异二聚体。

其中，sp为信号肽(signalpeptide)；linker为连接序列，furin为furin蛋白酶剪切位点，2a为2a自剪切位点。furin剪切位点的氨基酸序列为r-x-[r/k]-r(比如rrkr)，x指代任一种氨基酸；e/kcoli为电性相反、配对的螺旋结构，且kcoli和ecoli可互换位置；2a包括e2a、f2a、p2a和t2a等。其中，anti-cd3.vh、anti-cd3.vl、anti-cd16.vh、anti-cd16.vl、anti-hpv-tcrl.vh、anti-hpv-tcr.vα、anti-hpv-tcrl.vl、anti-hpv-tcr.vβ各元件的氨基酸序列及其编码基因与上述(1)中的一致。

(3)dart-fc结构：

dart-fc表达框经翻译、剪切后形成两条链(chain1、chain2)；chain1和chain2通过配对的e/k-coli以及fc“knob-into-hole”结构形成稳定的异二聚体。“knob-into-hole”设计既可避免同二聚体的产生，还能增加半衰期。

其中，sp为信号肽(signalpeptide)；linker为连接序列，furin为furin蛋白酶剪切位点，2a为2a自剪切位点。furin剪切位点的氨基酸序列为r-x-[r/k]-r(比如rrkr)，x指代任一种氨基酸；e/kcoli为电性相反、配对的螺旋结构，且kcoli和ecoli可互换位置；fc-knob和fc-hole分别为iggfc段ch2-ch3突变体，它们也可互换位置；2a包括e2a、f2a、p2a和t2a等。其中，anti-cd3.vh、anti-cd3.vl、anti-cd16.vh、anti-cd16.vl、anti-hpv-tcrl.vh、anti-hpv-tcr.vα、anti-hpv-tcrl.vl、anti-hpv-tcr.vβ各元件的氨基酸序列及其编码基因与上述(1)中的一致。

实施例2、微环dna载体的构建以及微环(mc)的制备

微环(mc)的制备方法如下：

1、合成hpv-btec的编码基因。

2、选择合适的位点双酶切微环dna空载体pmc.bespx。

3、使用seamless克隆或者传统克隆方法(如，酶切-连接)将hpv-btec的编码基因插入双酶切后的空载体pmc.bespx中，构建成微环dna载体(pmc.hpv-btec)。

4、微环载体(pmc.hpv-btec)分别转化大肠杆菌ecoli.zycy10p3s2t，按标准微环制备方法得到相应的微环dna(mc.hpv-btec)。

其中，微环dna空载体pmc.bespx、工程菌ecoli.zycy10p3s2t，以及微环制备方法见参考文献natbiotechnol.2010,28:1287-1289.

实施例3、hpv工程抗体(hpv-btec)的表达和纯化

一、hpv-btec的表达方法

采用superfect质粒转染试剂盒(invitrogen公司)将上述微环dna转染293t细胞，在无血清培养基中培养三天后分别收集293t细胞培养上清。

二、hpv-btec的纯化方法

1、收集细胞培养上清液进行低温超速离心，取上清。

2、hpv-btec利用his-tag亲和树脂(completehis-tagpurificationresin，roche)纯化。

3、纯化后的蛋白使用page或westernblot定性检测，并使用bradford法定量检测蛋白浓度。

4、纯化产物置于-20℃或-80℃长期保存。

实施例4、hpv-btec的结合实验

采用流式细胞术检测hpv-btec与靶细胞(targets，t)、效应细胞(effector，e)的结合活性，包括如下步骤：

1、细胞培养：靶细胞(hpv阳性细胞,比如hela)；效应细胞(t细胞或nk细胞)。

2、收集细胞：贴壁细胞使用胰酶消化，加含血清培养基中和后离心弃上清得细胞；悬浮细胞直接离心收集。

3、两种细胞均用预冷pbs洗涤2次，200g离心4min，收集细胞，分别计数。

4、每个实验组分别分配1×10⁵个靶细胞和效应细胞，分组如下：

空白组(不加hpv-btec)和hpv-btec组

5、加入hpv-btec溶液100μl/组，冰上孵育30min。

6、加入1ml预冷pbs洗涤，200g离心4min，收集细胞，加事先预冷并混好anti-flag抗体的pbs100μl，冰上孵育30min。

7、加入1ml预冷pbs洗涤，200g离心4min，收集细胞，加入100μlpbs重悬，上流式观察结合情况。

实施例5、hpv-btec介导效应细胞杀伤靶细胞

一、实验分组

实验材料：效应细胞(e，cik细胞)，靶细胞(t，caski细胞)，hpv-btec(结合hpv16型e6蛋白/cd3的双特异性抗体，anti-hpv16-hla-a2/e6/cd3-btec)

具体分组和实验材料的用量如下表所示：

二、实验方法

1、提前1天将靶细胞(t，caski细胞)接种于96孔板上，细胞接种量为2×10⁴/孔。

2、第二天更换新鲜opti-mem培养基，100μl/孔。

3、效应细胞(e，cik细胞)计数并重悬于opti-mem培养基中，按照各个分组中e：t的比例，加入相应数量的效应细胞。

4、在相应的孔中每孔加入纯化的hpv-btec，终浓度为10ng/ml，混匀。

5、37℃细胞培养箱孵育6小时。

6、加入cck8(dojindo，日本)试剂(20μl/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度。

7、根据cck8试剂盒(dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：

杀伤率＝[((t+e)-t&e)/t]×100％

其中，t代表活的靶细胞数量；e代表活的效应细胞数量；则t+e等于活的靶细胞和效应细胞的总数；t&e代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。二、实验结果

图7显示了hpv-btec介导效应细胞杀伤靶细胞的结果图。当效应细胞的浓度为靶细胞的2.5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用非常微弱。而hpv-btec能够将效应细胞的杀伤作用提高12％左右。当效应细胞的浓度为靶细胞的5倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用为15％左右。而hpv-btec能够将效应细胞的杀伤作用再次提高3倍以上。当效应细胞的浓度为靶细胞的10倍时，效应细胞对靶细胞的杀伤作用，与是否存在hpv-btec相差不大。可见，在通常的生理条件下，hpv-btec能够大幅度提高效应细胞对靶细胞的杀伤作用。

sequencelisting

<110>深圳新诺微环生物科技有限公司

<120>微环dna表达抗hpv治疗性工程抗体及其应用

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<213>btec抗靶细胞hla-a2/e6的sctcrvβ氨基酸序列

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