一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

小麦全蚀病是由禾顶囊壳(gauemannomycesgraminic)引起的土传真菌病害，是小麦根部重要的病害之一。小麦全蚀病菌的危害部位主要是根部和茎基部15cm处，在小麦苗期到成株期均能致病，引起小麦植株矮小、干枯和白穗等症状。小麦全蚀病菌主要以菌丝体的形式在土壤及病残体中越冬越夏，其蔓延速度较快，只需几年即可扩散传染整块田地。因此，快速准确检测麦田土壤中小麦全蚀病菌，对小麦全蚀病的早期诊断、预测预报和综合防治具有重要意义。

目前，小麦全蚀病菌分子检测方法主要包括聚合酶链式反应(pcr)、限制性片段长度多态性dna标记(rflp)和实时荧光定量pcr技术(real-timepcr)。pcr和real-timepcr检测灵敏度高，且可实现对该病菌的定量检测，但该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高。因此，继续开发对小麦全蚀病菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种新兴的恒温扩增技术，在37℃-42℃恒温条件下20min即可完成反应。rpa反应主要有三个过程：重组酶与rpa引物结合形成核蛋白微丝，向模板dna移动，并将引物与模板dna序列进行比对；引物与模板dna发生碱基互补配对时，核蛋白微丝与模板dna发生重组反应，并在单链结合蛋白的作用下，模板dna解链；在dna聚合酶的作用下，进行rpa扩增反应。结合侧向流层析试技术，可在10min内完成rpa扩增产物的检测，即利用rpa技术可在30min内完成对目标生物的可视化检测。目前，rpa技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在小麦全蚀病菌检测方面的报道。

技术实现要素：

1、要解决的问题

针对小麦全蚀病菌尚无有效进行rpa技术检测的问题，本发明提供一种用于检测土壤小麦全蚀病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法，为土壤中小麦全蚀病菌的现场检测和早期诊断提供新方法。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的rpa引物和rpa探针，

所述的rpa引物基于小麦全蚀病菌β-tubilin基因设计，

所述的rpa引物的上游引物如seqidno：1所示，

所述的rpa引物的下游引物如seqidno：2所示；

所述的pra探针根据所述的rpa引物扩增区域设计，

所述的rpa探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用fam标记，3’端用c3-spacer修饰，且在rpa探针的序列中间距5’端的33bp处进行thf修饰。

优选地，所述的rpa引物的下游引物包括如seqidno：2所示的序列，且其5’端用biotin修饰；所述的rpa探针包括如seqidno：3所示的序列，其5’端用fam标记，3’端用c3-spacer修饰，且在rpa探针的序列中间距5’端的33bp处进行thf修饰。

一种含有上述所述的rpa引物和rpa探针的用于检测土壤中小麦全蚀病菌的试剂盒。

优选地，所述的试剂盒还包括rpa反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。

一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，

包括以下步骤：

(1)提取样品中的dna；

(2)以步骤(1)提取的dna作为待检测dna模板，采用上述所述的rpa引物和rpa探针，在rpa反应管中进行rpa扩增反应；

(3)分析rpa扩增产物。

优选地，步骤(1)中所述的样品为小麦全蚀病菌菌丝，所述的rpa引物和rpa探针的检出限为10pg/μldna。

优选地，步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计为：

优选地，步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃)下反应20分钟，随后冰上终止反应。

优选地，步骤(3)中分析rpa扩增产物的方法包括如下步骤：取rpa扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带(即为检测带)，而且质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中含有小麦全蚀病菌，若试纸条仅质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中不含有小麦全蚀病菌。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明rpa引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将rpa技术应用到小麦全蚀病菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中rpa引物和探针基于小麦全蚀病菌β-tubilin基因设计，可稳定扩增且特异性较高，对小麦全蚀病菌的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38℃下和30min内完成对小麦全蚀病菌dna的恒温扩增和可视化检测，无需pcr仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，建立的土壤中小麦全蚀病菌rpa检测方法操作简单且结果易判定，为小麦全蚀病的早期诊断和指导科学施药提供有力技术支持。

附图说明

图1为实施例2小麦全蚀病菌rpa检测方法的建立的检测结果图；

图2为实施例3小麦全蚀病菌rpa引物和探针的特异性检测结果图；

图3为实施例4小麦全蚀病菌rpa引物和探针的灵敏度检测结果图；

图4为实施例5皖北麦区小麦全蚀病发病情况的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例中使用的rpa反应管以及反应缓冲液均购自英国twistdx公司，商品编号tanfo02kit；其中，重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶以rpa冻干粉状态存在于rpa反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个rpa扩增反应在rpa反应管中进行。

实施例1

将小麦全蚀病菌用于rpa引物和探针的筛选。根据twistdx操作手册要求，以小麦全蚀病菌β-tubilin基因为靶标，设计用于rpa试剂盒(twistampnfo)的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物(即为rpa引物的上下游引物)序列如seqidno：1和seqidno：2所示。随后，对上述引物进行修饰，在rpa引物的下游引物5’端加入一个生物素(biotin)标记位点，另外，根据rpa引物扩增片段设计一条大小为45bp-54bp的探针，探针的5’端用fam标记，3’端进行c3-spacer修饰，且在探针中间距5’端33bp处进行thf修饰。最后根据要求筛选得到用于检测小麦全蚀病菌的灵敏度高、特异性强的rpa引物和探针，它们的序列如下：

上游引物gg-rpa-f(seqidno.1)：5’-cacctcggagctccagctcgagcgcatgagcgtc-3’，

下游引物gg-rpa-r(seqidno.2)：5’-biotin-ggggcggaacagctggccgaagggaccggcacg-3’；

探针gg-lf-probe(seqidno.3)：5’-fam-attccccaccttcgtgttcttattctgaccca-(thf)-taacctttccgctccagg-(c3-spacer)-3’。

实施例2

小麦全蚀病菌rpa检测方法的建立

本实施例的用于检测小麦全蚀病菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的dna；

(2)以步骤(1)提取的dna作为待检测dna模板，采用实施例1中所述的rpa引物和rpa探针，在rpa反应管中进行rpa扩增反应；

步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为：38℃下反应20分钟，随后冰上终止反应；

步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计为：

(3)分析rpa扩增产物；取rpa扩增产物与缓冲液混匀制备混合液(取上述1μlrpa扩增产物加入49μlpbst缓冲液中混匀，其中所述的pbst缓冲液中含0.1％吐温-20的pbs缓冲液)，将试纸条(mileniagenlinehybridetect-1，德国mileniabiotec公司)上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有小麦全蚀病菌，若试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有小麦全蚀病菌。

如图1所示，分别进行阳性对照模板与阴性对照模板的试验，阳性对照模板为小麦全蚀病菌的dna，阴性对照模板为ddh2o。图1中的标号“1”指的是阳性对照模板的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，且质控线位置出现条带；图1中的标号“2”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见试纸条仅质控线位置出现条带。

上述图1的检测结果图表明本发明rpa引物和探针可稳定扩增。

实施例3

小麦全蚀病菌rpa引物和探针的特异性检测

本实施例的用于检测小麦全蚀病菌的检测方法同实施例2，不同在于：

所述的样品分别为小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌、根腐平脐乳孢、禾谷镰孢菌、假禾谷镰刀菌、玉米纹枯病菌、层出镰孢菌、棉花立枯病菌。

如图2所示，图2中的标号“1”指的是小麦全蚀病菌的检测结果，图2中的标号“2”指的是小麦纹枯病菌的检测结果，图2中的标号“3”指的是根腐平脐乳孢的检测结果，图2中的标号“4”指的是禾谷镰孢菌的检测结果，图2中的标号“5”指的是假禾谷镰刀菌的检测结果，图2中的标号“6”指的是玉米纹枯病菌的检测结果，图2中的标号“7”指的是层出镰孢菌的检测结果，图2中的标号“8”指的是棉花立枯病菌的检测结果；

上述图2的检测结果图表明，仅小麦全蚀病菌的检测结果的检测线位置和质控线位置同时出现条带，而其他病菌的检测结果仅质控线位置出现条带，这表明本发明rpa引物和探针特异性较高。

实施例4

小麦全蚀病菌rpa引物和探针的灵敏度检测

本实施例的用于检测小麦全蚀病菌的检测方法同实施例2，不同在于：

提取小麦全蚀病菌菌丝的基因组dna，按10倍梯度依次稀释为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0fg/μl。

如图3所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”、“10”分别指的是不同浓度(100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0fg/μl)基因组dna的检测结果。

上述图3的检测结果图表明，小麦全蚀病菌dna的检出限为10pg/μl。

实施例5

皖北麦区小麦全蚀病菌发病情况

为了验证小麦全蚀病菌的rpa检测技术的实用性，对采集自皖北麦区10份疑似小麦全蚀病发病田块的土壤分别进行rpa检测，土壤中小麦全蚀病菌的rpa检测方法同实施例2。

图4为土壤中小麦全蚀病的检测结果图，标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、“9”、“10”分别指的是10份疑似小麦全蚀病菌发病田块的土壤，标号“11”指的是健康土壤。

上述图4的检测结果图表明，9份小麦全蚀病菌发病田块的土壤中检测到小麦全蚀病菌，1份土壤中未检测到小麦全蚀病菌，健康土壤中也未能检测到小麦全蚀病菌，这表明本发明小麦全蚀病菌rpa引物和探针具有较强的实用性。

综上所述，由实施例1-5可见，本发明rpa引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将rpa技术应用到小麦全蚀病菌的分子检测方面，可在30min内完成小麦全蚀病菌的可视化检测，极大提升了土壤中小麦全蚀病菌的检测效率，同时降低对仪器设备、实验人员素质的要求，为小麦全蚀病的早期诊断、病害测报和农药减量使用提供了有力的技术支持。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法

<141>2018-08-05

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>禾顶囊壳(gauemannomycesgraminic)

<400>1

cacctcggagctccagctcgagcgcatgagcgtc34

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>禾顶囊壳(gauemannomycesgraminic)

<400>2

ggggcggaacagctggccgaagggaccggcacg33

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>禾顶囊壳(gauemannomycesgraminic)

<400>3

attccccaccttcgtgttcttattctgacccataacctttccgctccagg50