一种壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法与流程

本发明属于抗菌性生物材料的制备技术领域，具体涉及新型的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法。

背景技术

近年来耐药性细菌甚至超级细菌的出现，迫使人类亟需研制新型抗菌剂用于面对此严峻挑战。与常规抗生素作用机制不同，天然抗菌肽通过破坏细菌细胞膜的方式实现其抗菌作用。由于其仅通过静电相互作用以及亲疏水相互作用杀灭细菌，这使得细菌难以产生耐药性。虽然天然抗菌肽有这一优点，但是由于生产成本高、稳定性差、细胞毒性高等缺点，限制了其在临床上的实际应用。

天然抗菌肽一般具有两个显著结构特征：表面两亲性和阳离子电荷。许多研究人员尝试采用人工合成的方法模拟天然抗菌肽结构，合成出一系列的阳离子氨基酸聚合物，此类抗菌肽与天然抗菌肽具有相似的性质。

壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的天然聚合物。近年来，由于其在生物医学方面应用的多样性，引起了科研工作者的广泛关注。特别是，壳聚糖作为一种抗菌剂已经被广泛报道。具有质子化铵的壳聚糖与细菌带负电荷的细胞膜作用，吸附和聚沉细菌，同时穿透细胞壁进入细胞内，扰乱细菌的新陈代谢而具有抗菌作用。

本发明中制备的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物，以壳聚糖为主链，接枝赖氨酸和缬氨酸共聚物。赖氨酸是亲水性最强的氨基酸之一，同时带有正电荷，易与细菌表面负电荷结合；缬氨酸是疏水性最强的氨基酸之一，赖氨酸与缬氨酸的共聚形成两亲性链段。以壳聚糖为主链增加了抗菌肽的稳定性，同时壳聚糖与抗菌肽两种抗菌剂协同作用，在中性介质中对大肠杆菌具有良好的杀菌抑菌作用。

技术实现要素：

本发明公开了一种新型的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法。该聚合物以壳聚糖为主链，以赖氨酸和缬氨酸共聚物为支链的接枝共聚物。本发明制备的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物具有在中性水中最低抑菌浓度低、最低杀菌浓度低的优点；同时此聚合物合成方法简单，合成原料成本低，易于实现大规模生产，尤其是其在中性介质中的抗菌性能使得其在抗菌领域具有很高的潜在应用价值。

本发明的技术方案：壳聚糖-g-抗菌肽聚合物合成方法分为两步：第一步为两种氨基酸衍生物的合成；第二步为通过nca-rop(n-carboxyanhydridering-openingpolymerization)反应两种氨基酸衍生物接枝到壳聚糖的氨基上，通过透析处理得到目标产物。

本发明所述的新型的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的制备方法，其具体步骤为：

氨基酸衍生物的合成：赖氨酸-n-羧酸酐和缬氨酸-n-羧酸酐两种氨基酸衍生物分别由苄氧羰基赖氨酸和缬氨酸与三光气反应得到。两种氨基酸衍生物制备过程类似，仅以赖氨酸-n-羧酸酐为例说明合成过程。在氮气氛下，取一定量的苄氧羰基赖氨酸溶于适量无水四氢呋喃中，同时伴以磁力搅拌。苄氧羰基赖氨酸与三光气反应的投料比为3:1，使用注射器将三光气逐滴加入到反应容器中。将混合物升温至50℃，反应3小时。待体系澄清后冷却至室温，用大量正己烷洗涤沉淀三次，离心分离得到沉淀产物，真空室温干燥得到白色固体即为赖氨酸-n-羧酸酐。

1)壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的合成：将由步骤1)得到的赖氨酸-n-羧酸酐和缬氨酸-n-羧酸酐以及壳聚糖按比例溶于无水n,n-二甲基甲酰胺，同时伴以磁力搅拌，室温条件下反应5d。产物用丙酮沉淀，过滤后真空干燥。对干燥后的产物进行脱保护处理，将产物溶于含有三氟乙酸和33％hbr的冰醋酸混合溶液中，室温下搅拌反应24h，用丙酮沉淀，过滤后真空干燥。将产物溶于蒸馏水中，用1mol/lnaoh将ph调节至7，使用截留分子量3500da的透析袋透析4d后，冷冻干燥得到最终产物。

本发明的有益效果：经过研究发现本发明制备的新型壳聚糖-g-抗菌肽聚合物在中性介质中对于大肠杆菌具有良好的抗菌活性，其最低抑菌浓度mic值为512μg/ml，最低杀菌浓度mbc值为2048μg/ml。相对而言，单纯的壳聚糖对于大肠杆菌的抗菌活性要低很多，其最低抑菌浓度mic值为2048μg/ml，最低杀菌浓度mbc值为4096μg/ml。

同时，基于临床实际应用考虑，新型壳聚糖-g-抗菌肽聚合物合成方法简单，合成原料成本低，易于实现大规模生产，尤其是其在中性介质中的抗菌性能使得其在抗菌领域将会有广泛的应用前景。

附图说明

图1实施例1中合成氨基酸衍生物的线路示意图

图2实施例1中合成壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的线路示意图

图3实施例1中制备的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的傅里叶变换红外光谱图

图4实施例2中壳聚糖-g-抗菌肽聚合物最低杀菌浓度mbc测定平板培养图(其中a，b，c，d中壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的浓度分别为0μg/ml，512μg/ml，1024μg/ml，2048μg/ml，)

图5实施例3中壳聚糖最低杀菌浓度mbc测定平板培养图(其中a，b，c中壳聚糖的浓度分别为0μg/ml，2048μg/ml，4096μg/ml，)

具体实施方式

实施例1

1)氨基酸衍生物的合成：赖氨酸-n-羧酸酐(lysnca)和缬氨酸-n-羧酸酐(valnca)两种氨基酸衍生物分别由苄氧羰基赖氨酸和缬氨酸与三光气反应得到。两种氨基酸衍生物制备过程类似，仅以赖氨酸-n-羧酸酐(lysnca)为例说明合成过程。在氮气保护下，取一定量的苄氧羰基赖氨酸溶于适量无水四氢呋喃中，同时伴以磁力搅拌。苄氧羰基赖氨酸与三光气反应的投料比为3:1，使用注射器将三光气逐滴加入到反应容器中。将混合物升温至50℃，反应3小时。待体系澄清后冷却至室温，用大量正己烷洗涤沉淀三次，离心分离得到沉淀产物，真空室温干燥得到白色固体即为赖氨酸-n-羧酸酐(lysnca)。

2)壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的合成：将由步骤1)得到的赖氨酸-n-羧酸酐和缬氨酸-n-羧酸酐以及壳聚糖按比例溶于无水n,n-二甲基甲酰胺，同时伴以磁力搅拌，室温条件下反应5d。产物用丙酮沉淀，过滤后真空干燥。对干燥后的产物进行脱保护处理，将产物溶于含有三氟乙酸和33％hbr的冰醋酸混合溶液中，室温下搅拌反应24h，用丙酮沉淀，过滤后真空干燥。将产物溶于蒸馏水中，用1mol/lnaoh将ph调节至7，使用截留分子量3500da的透析袋透析4d后，冷冻干燥得到最终产物。

实施例2

取实施例1得到的壳聚糖-g-抗菌肽聚合物固体，配置成不同浓度梯度的中性水溶液，分别为4096μg/ml，2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，0μg/ml。在37℃振荡孵育条件下，使得大肠杆菌在lb培养液中达到细菌的对数增长期。在lb培养液中稀释到细菌浓度为10⁴-10⁵cfuml^-1。将100μl大肠杆菌培养液与400μllb培养液，500μl壳聚糖-g-抗菌肽聚合物水溶液混合，加入离心管。在37℃孵育24小时，培养基澄澈透明，无明显细菌生长的浓度确定为最低抑菌浓度(mic)，实验结果显示，mic值为512μg/ml。将空白组、最低抑菌浓度以及更高浓度的离心管中的菌悬液进行逐级稀释，取各级稀释菌悬液100μl，均匀涂布在平板琼脂培养基表面，37℃孵育12小时，统计菌落数目，无细菌菌落生长的浓度定义为最低杀菌浓度(mbc)，实验结果显示，其mbc值为2048μg/ml。

实施例3

将壳聚糖按实施例1制备壳聚糖-g-抗菌肽聚合物的方法做相同处理，配置成不同浓度梯度的中性水溶液，分别为8192μg/ml，4096μg/ml，2048μg/ml，1024μg/ml，512μg/ml，256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，0μg/ml。在37℃振荡孵育条件下，使得大肠杆菌在lb培养液中达到细菌的对数增长期。在lb培养液中稀释到细菌浓度为10⁴-10⁵cfuml^-1。将100μl大肠杆菌培养液与400μllb培养液，500μl壳聚糖水溶液混合，加入离心管。在37℃孵育24小时，培养基澄澈透明，无明显细菌生长的浓度确定为最低抑菌浓度(mic)，结果显示，其mic值为2048μg/ml。将空白组、最低抑菌浓度以及更高浓度的离心管中的菌悬液进行逐级稀释，取各级稀释菌悬液100μl，均匀涂布在平板琼脂培养基表面，37℃孵育12小时，统计菌落数目，无细菌菌落生长的浓度定义为最低杀菌浓度(mbc)，实验结果显示，其mbc值为4096μg/ml。