一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法与流程

本发明涉及发酵工程领域，具体是一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法。

背景技术

mdhs(低温苹果酸脱氢酶)作为生物体中心代谢途径的关键酶，在遗传变异和个体发育等具有重要的研究价值，并在临床诊断、工业检测具有广泛应用，市场需求量与日俱增，价值巨大。自上世纪50年代，就已经有学者从动物心肌中分离出mdhs。现阶段，市场上商业化的mdhs来源主要是猪、兔、牛的心肌、肝脏、骨骼肌中提取。原料成本低、来源广，但提取工艺繁琐，产品酶活较低。因此，拓展新的来源显得尤为重要。而海洋微生物是巨大的资源宝库。从中筛选新型的、低温的、高活性的目的mdhs产生菌株显得尤为重要。mdhs广泛存在于自然界生物体内，但如何准确筛选出高产mdhs菌株，目前没有具体的方法。

由于目前对产mdhs的菌株筛选没有具体相关的筛选方法，因此，研究其筛选方法对高产mdhs的研究十分必要。

技术实现要素：

为筛选出高产mdhs细菌菌株，本发明提供一种新的筛选方法，采用溴甲酚绿-mtt二步的筛选方式筛选出高产低温苹果酸脱氢酶活性强的细菌菌株。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从深海海泥、海水中采集样本；

(2)初筛：步骤(1)中采集的样本进行梯度稀释，涂布于含有溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基，25℃，恒温培养3-4天；

(3)纯化：挑取步骤(2)中生长旺盛、黄绿色透明圈较大的菌落接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基进行分离纯化，25℃，恒温培养1-2天，此步骤重复2-4次；

(4)复筛：将步骤(3)纯化的菌落用接种针沾取单个菌落，穿刺接种至mtt牛肉膏蛋白胨半固体培养基1/3深度；

(5)筛选：选取沿穿刺线扩散到未穿刺的培养基部位呈弥漫蓝色云雾状的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，25℃，恒温培养1-2天；

(6)将步骤(5)得到的菌株以5％接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，150rad，25℃，摇床培养1-2天，菌体超声破碎，测酶活，筛选产酶活性高的菌株，得到高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，步骤(2)中含溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基的溴甲酚绿含量为0.1-0.2g/l。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，步骤(3)中mtt牛肉膏蛋白胨半固体培养基的mtt的含量为0.015g/l。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，所用培养基均由海盐水配制。

本发明利用mdhs可以催化草酰乙酸生成l-苹果酸这一特性，通过溴甲酚绿，进行初筛(溴甲酚绿在ph＝3.8时呈黄色，ph＝5.4时呈蓝绿色)，筛选出产酸性较强的菌株，利用mtt来检测菌株的动力性，来进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选，可以从茫茫菌株中缩小范围，更加快捷、准确的筛选出高产mdhs的低温菌株，最后通过检测酶活，来最终确定高产菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种高产低温苹果酸脱氢酶细菌的筛选方法，本发明所用筛选培养基，添加了溴甲酚绿和mtt作为筛选靶标，采用溴甲酚绿-mtt二步筛选方式筛选低温高产酶微生物，可在20天内方便、准确地筛选低温高产胞内苹果酸脱氢酶的细菌菌株，弥补了苹果酸脱氢酶筛选培养基相关领域的空白。

附图说明

图1初筛菌株透明圈；

图2mtt复筛菌株；a.实施例1中mtt复筛菌株b.实施例2中mtt复筛菌株；

图3胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)w1的菌落形态；

图4胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)w1个体形态(10x10)；

图5粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)z5的菌落形态；

图6粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)z5的个体形态(10x10)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

本发明筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，具体如下：

(1)菌株初筛：取中国辽宁大连渤海海域附近的海泥海水样品，在以含0.1g/l的溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行稀释涂平板，25℃，恒温培养3-4天；根据菌落周围生成的黄绿色圈的颜色偏黄程度和颜色圈直径比值的大小来判断初筛高活力目的菌株，采用三局划线的方法接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，琼脂20g/l，海水配置，ph7.2)进行纯化培养，25℃，恒温培养1-2天，此步骤重复2-4次；

(2)菌株复筛：将上述菌落用接种针沾取单个菌落，穿刺接种至mtt半固体培养基1/3深度，mtt的含量为0.015g/l，穿刺接种时需避光操作；选取沿穿刺线扩散到未穿刺的培养基部位呈弥漫蓝色云雾状的菌株(见图2a)，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，25℃，恒温培养1-2天；其中，配制mtt牛肉膏蛋白胨半固体培养时，将牛肉膏蛋白胨半固体培养基121℃、0.1mpa灭菌20min后，使培养基凉至≤40℃，将过滤除菌之后的0.015g/lmtt溶液加入培养基，摇匀后分装倒平板。

(3)测酶活：将步骤(2)得到的菌株以5％接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基,150r/min，25℃，摇床培养1-2天，菌体超声破碎，测酶活，同时nadh在340nm处有最大吸光值,苹果酸脱氢酶的酶活是通过用紫外分光光度计检测在340nm处nadh吸光值的减少量来测定的。筛选产酶活性高的菌株，得到一株高产低温mdhs的菌株，将纯化后的单菌落，革兰氏染色法为阳性，显微镜下观察为长杆状(见图1)，菌落外周有较厚的多糖外壳，不易被挑取，疑似胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosus)，编号w1(见图3、图4)。

实施例2

本发明筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，具体如下：

(1)菌株初筛：取中国山东青岛黄海海域附近的海泥海水样品，在以含0.15g/l的溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行稀释涂平板，25℃，恒温培养3-4天；根据菌落周围生成的黄绿色圈的颜色偏黄程度的和颜色圈直径比值的大小来判断初筛高活力目的菌株，采用三局划线的方法接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基进行纯化培养，25℃，恒温培养1-2天，此步骤重复2-4次；

(2)菌株复筛：将上述菌落用接种针沾取单个菌落，穿刺接种至mtt半固体培养基1/3深度，mtt的含量为0.015g/l；选取沿穿刺线扩散到未穿刺的培养基部位呈弥漫蓝色云雾状的菌株(见图2b)，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，25℃，恒温培养1-2天；

(3)测酶活：将步骤(2)得到的菌株以5％接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，150rad，25℃，摇床培养1-2天，菌体超声破碎，测酶活，筛选产酶活性高的菌株，得到一株高产低温mdhs的菌株，将纯化后的单菌落，革兰氏染色法为阴性，显微镜下观察为近球形短杆菌(见图2)，菌落粘稠，易被挑取，疑似粘性沙雷氏菌(serratiamarcescens)，编号z5(见图5、6)。